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Nota técnica – vamos por a mão na massa

Aqui em Stanford o desenvolvimento de tecnologia é uma das prioridades (afinal, estamos no vale do Silício), assim como a adoção de novas técnicas desenvolvidas em outro cantos. Vou entrar um pouco na onda e falar um pouco de uma novidade na citometria de fluxo ou facs.

O uso da fluorescência na citometria de fluxo tem as suas limitações, e mesmo no melhor dos casos, 15 parâmetros é o limite, e haja compensação. Com isto, análises mais complexas incorporando vários marcadores se tornam difícies de fazer, ou requerem marcações separadas, prejudicando uma análise mais integrada, e claro usando mais material (tanto biológico quanto reagentes).

Entra em cena o CytofM (Cytometry by Time Of Flight mass spectrometry). Desenvolvido no Canadá, o Gary Nolan (professor aqui em Stanford) foi quem apresentou a coisa para nós. Com o seu usual entusiasmo por novas tecnologias, ele apresentou o Cytoff modestamente como o futuro do facs (um futuro “quente” como ele disse).

O Cytof usa a espectrometria de massa na detecção de anticorpos marcados com elementos químicos (aqueles da tabela periódica), em vez de marcadores ópticos. A espectrometria de massa usada no Cytof é a “Inductively coupled plasma mass spectrometry” (ICP-MS), um tipo de espectrometria que – assim me disseram - tem uma grande resolução entre os elementos, uma escala ampla de detecção e boa quantificação. No procedimento, simplificado, as células são marcadas com os anticorpos acoplados à elementos químicos, separadas em single cells droplets por nebulização e ionizadas (a mais de 7000°C). O espectrômetro de massa separa e detecta os íons. Os dados de cada célula são assim detectados e integrados, e os arquivos .FCS são produzidos, como numa citometria de fluxo normal (Figura). Uma das vantagem deste sistema é que um número grande de elementos podem ser potencialmente usados (mais de 60 com os intrumentos disponíveis no momento) e com pouca sobreposição entre os diferentes parâmetros, isto é, sem necessidade de compensação. O background também parece ser bem baixo.

Desvantagens? Bom, como o Gary Nolan nos lembrou, não dá para usar o Cytof para fazer sorting… Também não tem parâmetros de tamanho/granularidade (FSC/SSC), então um marcador de DNA e outros recursos (“cell length”) tem que ser usados para determinar a distribuição celular. Os intrumentos atuais são também mais lentos (500 células/seg) do que o Facs. Para não se falar no custo da máquina… Mas aí obviamente não é algo para laboratórios individuais. Aqui o Cytof é de uso comum, e com certeza houve um desconto camarada para Stanford. Teoricamente o preço dos reagentes é mais baixo do que a imunofluorescência.

O grupo do Gary Nolan publicou recentemente um extenso artigo introduzindo o que eles batizaram de “citometria de massa”, comparando a citometria de fluxo e o Cytof (Bendall et al, 2011), e concluindo que o Cytof e o Facs tradicional são comparáveis em relação à marcações tradicionais. Com a vantagem de que com Cytof eles puderam usar 34 parâmetros na mesma amostra, e análises muito mais extensas puderam ser conduzidas, integrando a identificação de populações celulares e marcadores de estados funcionais, como ativação e fosforilação. A idéia é que o Cytof possibilite estudos mais detalhados e integrados de amostras complexas como sangue total e medula óssea, tanto em relação à mecanismos envolvidos em doenças como respostas à drogas e outros estímulos. Vamos ver no que vai dar o churrasquinho de células.

Bendall et al, 2011
Science. 2011 May 6;332(6030):687-96.
Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum.