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quinta-feira, 15 de julho de 2010

Conjugação de fluoróforos a anticorpos - Faça Você Mesmo


Você alguma vez já teve que deixar de usar uma combinação de anticorpos em citometria porque eles eram da mesma cor? Pois seus problemas acabaram!


Uma técnica que nós usamos muito nos laboratórios onde eu trabalho é a conjugação de fluoróforos a anticorpos mono ou policlonais (fluorescent antibody labeling Tabajara) para gerar novos reagentes para citometria de fluxo e imunofluorescência. Embora essa seja uma técnica simples e extremamente útil, é surpreendente como ela é pouco difundida entre os imunologistas.

Basicamente, a técnica consiste na conjugação de fluoróforos (como FITC, CyX ou AlexaXXX) diretamente a anticorpos purificados (ou qualquer outra proteína) por meio de uma reação química que liga o fluoróforo a lisinas presentes na superfície da proteína. A reação é bem simples e pode ser feita em qualquer laboratório. As vantagens de dominar essa técnica são óbvias, e incluem:

1) a possibilidade de comprar um só tubo de anticorpo purificado e conjugá-lo a vários fluoróforos diferentes (como FITC ou Alexa488 (FL-1), Cy5 ou Alexa647 (FL-4), Alexa700 (que é lido pela maioria dos citômetros mais modernos) e Cy3 ou Alexa546 (mais propício para microscopia de fluorescência). Isso não só diminui muito o preço do reagente (especialmente no caso do FITC, que é muito barato) como também permite novas combinações de anticorpos que ás vezes não seriam possíveis só com reagentes comerciais;

2) a melhora da especificidade de algumas reações - reações usando anticorpos diretamente conjugados a fluoróforos sao em geral mais específicas do que reações usando anticorpos secundários;

3) a possibilidade de gerar reagentes para imunofluorescência e citometria a partir de anticorpos mono ou policlonais gerados no próprio laboratório.

Como o meu laboratório tem muitos anos de prática com essa técnica, coloquei o nosso protocolo (extremamente detalhado) à disposição aqui.


Aproveitem!

Abraço


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5 comentários:

  1. Gostei bastante do post. Além de útil, ajuda a nos lembrar que não é necessário comprar tudo já feito.

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  2. Olá Gabriel!

    Gostei muito da possibilidade, inclusive ajudaria muito no meu projeto. Mas o link não está abrindo aqui. Será que poderias enviar um novo link? Muito Obrigada!

    Elis A. Rosa
    elis.biologia@gmail.com

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  3. OK, link consertei o link. Me avisem se ainda estiver quebrado.

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  4. Muito útil! Fiz o download e vou distribuir para os meus alunos.

    Abraços, Tiago.

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  5. Consegui visualizar o arquivo no GoogleDocs, mas não estou conseguindo fazer o download, nem tampouco imprimir. Tentei com vários computadores diferentes e com vários navegadores.
    Alguem que conseguiu o pdf poderia disponibilizar em um outro link para que eu pudesse fazer o download?
    Grata

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