Comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP): Citometria com até 17 parâmetros

Quando procuramos novas teorias, conceitos, ou descobertas intrigantes que podem por em xeque dogmas da imunologia, geralmente recorremos a revistas de alto impacto como Nature, Science, Immunity, etc. Entretanto, há uma revista que não possui um impacto tão alto como essas (2,347 – baixo na verdade quando comparado às anteriores), e que não traz especificamente novos conceitos ou descobertas, mas ao contrário, descreve novas metodologias que muitas vezes eram o elemento que faltava para que muitas dessas novas descobertas ocorressem. Esta revista, a qual gosto muito de ler, é a “Journal of Immunological Methods”. Desde metodologias simples, como a aplicação de CFSE para estudar divisão celular (Lyons e Parish, 1994) ou até metodologias mais elaboradas, como uma mais recentemente publicada, usada para isolar células Th17 por sorting (Streeck et al., 2008), são exemplos de artigos publicados na revista que trazem metodologias que foram e podem ainda ser extremamente úteis nas pesquisas em imunologia. Procurando por artigos desta revista, deparei com uma edição especial devotada ao uso de citometria (que eu uso muito) para desenvolvimento de novas drogas e biomarcadores (Volume 363 (2), 5 de janeiro de 2011). Um artigo em especial, de pesquisadores do NIH, nesta edição, me chamou a atenção: “High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research”, (Biancotto et al., 2011). O artigo introduz um novo termo em imunologia, a imunofenotipagem compreensiva de leucócitos (traduzindo ao pé da letra) que é na verdade uma abordagem sistêmica da fenotipagem de leucócitos feita por citometria, usando-se 17 parâmetros simultâneos por tubo (incluindo FSC e SSC). Nesta abordagem, um único tubo (dentro de um determinado gate em FSC x SSC) possibilita a identificação de 215 (32.767) subtipos de leucócitos; isso contando apenas células positivas ou negativas, não incluindo populações high e low, o que faria o número aumentar muito. Entretanto, aplicando-se devidas exclusões a alguns parâmetros redundantes, como CD3, CD4, CD8 e CD19, por exemplo, esse número diminui, porém, o número de subtipos de leucócitos continua alto. No caso do exemplo mostrado no artigo, em um painel de 10 tubos contendo células mononucleares de sangue periférico de doadores saudáveis, com 17 parâmetros cada, é possível identificar até 28.000 subtipos de leucócitos, aplicando-se as exclusões mencionadas acima. Dentro deste imenso repertório, é possível analisar a fundo as subpopulações já conhecidas, bem como identificar, separar e caracterizar novas subpopulações de leucócitos. Além disso, a abordagem permite estabelecer padrões de expressão de moléculas de superfície e citocinas dentro das diversas subpopulações, associados com homeostase, doenças, resistência ou susceptibilidade a doenças, eficácia de vacinas e tratamentos, etc. Porém, neste tipo de metodologia, nem tudo são flores. O grande número de padrões faz com que a análise seja algo bem complicado, e para um único tubo com 17 parâmetros, sejam necessários 105 dotplots bidimensionais para analisar todas as combinações. Entretanto, os autores mencionam um novo programa de análise em citometria (GemStone®) que junta os dados obtidos na aquisição, criando modelos de subtipos celulares, baseado em relações já conhecidas ou fornecidas ao programa entre os subtipos e suas marcações características. Abaixo está um gráfico criado pelo programa mostrando a variação da intensidade de fluorescência de alguns marcadores na diferenciação de células desde naive até efetoras e subtipos de memória (A: CD4+; B: CD8+; C: CD4+CD25high).

Além deste artigo, a edição também traz outros muito bons, que trazem dicas para preparação e padronização, bem como controle de qualidade de ensaios de citometria. Para quem utiliza bastante a técnica (e sabe o quanto pode haver erros de interpretação de resultados quando ela não é executada corretamente), ou está começando a utilizá-la, vale a pena a leitura desta edição.

Post de Diego Luis Costa. FMRP-IBA.

Referências:

Lyons AB, Parish CR. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J Immunol Methods, 171 (1): 131-7, 1994.

Streeck H, Cohen KW, Jolin JS, Brockman MA, Meier A, Power KA, Waring MT, Alter G, Altfeld M. Rapid ex vivo isolation and long-term culture of human Th17 cells. J Immunol Methods, 333(1-2): 115-25, 2008.

Biancotto A, Fuchs JC, Williams A, Dagur, PK, McCoy Jr, P. High dimensional flow cytometry for comprehensive leukocyte immunophenotyping (CLIP) in translational research. J Immunol Methods, 363(2): 245–261, 2011.

Edição especial da revista:

Flow Cytometry-based Biomarkers in Translational Medicine and Drug Development. 363(2): 101-262, 2011. Editado por Virginia Litwin e Maurice R.G. O'Gorman.