Como analisamos nossos experimentos de citometria de fluxo?

Atualmente, imunologistas utilizam rotineiramente a citometria de fluxo para buscar respostas para as mais variadas perguntas. Quando falamos nessa técnica, consigo enxergar três diferentes etapas dentro de um experimento:

1) obtenção da amostra e marcação desta com anticorpos acoplados a compostos fluorescentes.

2) passagem de cada amostra através do citômetro de fluxo, quando células serão transformadas em arquivos (eu chamo essa fase de aquisição).

3) análise dos dados obtidos para a geração de cada valor de interesse, quando para cada amostra são montados gráficos com populações e subpopulações conforme a pergunta a ser respondida.

É sobre a terceira etapa que quero questionar. Como vocês analisam? Será que podemos melhorar?

Com avanços técnicos na área temos citômetros de fluxo cada vez mais completos (e complexos) e, embora ainda seja uma técnica restrita, vários laboratórios brasileiros têm estrutura para realizar experimentos com muitas fluorescências ao mesmo tempo. Em Ribeirão Preto, por exemplo, temos capacidade de fazer oito fluorescências distintas. Com o aumento na complexidade dos experimentos, será que devemos modernizar nossas estratégias e ferramentas de análise de dados? Atualmente utilizo apenas os caminhos para identificação de uma dada população, uma abordagem de "Gates" ou populações em sequência de "Gates" em linfócitos; "Gate" em CD4+; "Gate em CD25+, como na figura 1:

Figura 1: Uma abordagem simples para verificar expressão de Foxp3 em linfócitos CD4+ CD25+ ou CD25-.

Porém, quando há um aumento no número de fluorescências utilizadas ao mesmo tempo, a análise torna-se complexa, difícil, com alto gasto de tempo, sujeita a erros e o que eu considero mais sério: através dela atentamos somente para populações que estariam alteradas de acordo com a hipótese inicial do experimento, deixando de lado outras populações que também podem estar alteradas, que podem modificar os rumos do projeto e estão prontas, "camufladas", dentro do arquivo gerado pelo citômetro. Para exemplificar a complexidade dos dados gerados, em um experimento com oito fluorescências é possível identificar populações positivas e negativas para cada uma delas, o que cria a probabilidade de 28 = 256 populações possíveis, tornando a análise bastante complexa. Será que dentro dessa probabilidade estamos enxergando todos os dados disponíveis? Vocês usam estratégias diferentes na análise de seus experimentos? Será que estamos deixando dados escaparem entre nossos dedos? Análises mais detalhadas trariam informações inusitadas?

Exemplo de ferramenta desenvolvida para esse tipo de abordagem é um software chamado SPICE (Simplified Presentation of Incredibly Complex Evaluations). Para sua utilização, é feita uma fase inicial, na qual populações positivas e negativas são determinadas em FlowJo (TreeStar Software) e posteriormente é utilizado o SPICE. Este software faz com que todas as combinações possíveis entre as fluorescências sejam analisadas, quantificando populações positivas para um ou mais parâmetros ao mesmo tempo, como no exemplo da figura 2, onde é analisada a população de CD4+ produtoras de IFN, TNF e/ou IL-2 em amostras submetidas a diferentes tratamentos. Eu tenho visto gráficos típicos deste software em algumas publicações em revistas de alto impacto, como Immunity, Journal of Experimental Medicine, Nature Medicine, Blood, entre outras e para quem nunca ouviu falar neste programa, talvez conheça as figuras bastante características geradas nessa análise, gráficos de pizza coloridos.

Figura 2: Um exemplo de análise usando SPICE, onde células CD4+ produtoras de IFN, IL-2 e TNF individualmente ou em qualquer combinação entre eles são quantificadas (C) e posteriormente classificadas em células que desempenham 1, 2 ou 3 funções (produzindo 1, 2 ou 3 citocinas) ao mesmo tempo (D). Modificado de Nat. Med. 13(7):pp. 843-50.

Fica aqui a pergunta: Como estamos analisando nossa citometria de fluxo? Será que podemos aprimorar nossas análises? Além de ferramentas de software como o exemplo citado, existem diferentes modelos matemáticos (algoritmos) que podem ser úteis na análise destes dados. Sobre esses assuntos, indico uma recente revisão, por Lugli e colaboradores (Cytometry A. 2010 Jul; 77(7): 705-13.), na qual diferentes abordagens, ferramentas matemáticas e de software, como SPICE, análise de clusters, "frequency difference gating" entre outros são discutidos em seus pontos positivos e negativos.

Referências Bibliográficas

Darrah PA, Patel DT, De Luca PM, Lindsay RW, Davey DF, Flynn BJ, Hoff ST, Andersen P, Reed SG, Morris SL, Roederer M, Seder RA. Multifunctional TH1 cells define a correlate of vaccine-mediated protection against Leishmania major. Nat. Med. 2007 Jul; 13(7): 843-50.

Lugli E, Roederer M, Cossarizza A. Data analysis in flow cytometry: the future just started. Cytometry A. 2010 Jul; 77(7): 705-13.