CD52-Siglec-10, mais uma forma de inibir a resposta de células T

Num recente trabalho publicado online na revista Nature Immunology (1), o grupo de pesquisa liderado pelo Leonard Harrison, da Australia, descreve um novo marcador de células T reguladoras. Os autores geraram múltiplos clones de células T CD4 humanas específicas para GAD65 e descobriram que uma minoria de esses clones ativados teve atividade supressora na ausência de contato célula-célula, o que não podia ser atribuída a fatores supressores solúveis já conhecidos. Incluindo o fenótipo CD4+Cd25+Foxp3+. A atividade supressora foi atribuída á produção de CD52 solúvel, que se liga em Siglec-10.

Os autores marcaram células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis, com CFSE e incubaram essas células durante 7d com GAD65, e então, classificaram as células T que tinham dividido (CFSEdim), fazendo diferentes “gates”, correspondentes às frações do 5%, 10% ou 20% que mais expressavam ou o restante 80% com a menor expressão do CD52, dentro das células T CD4 + que não dividiram. Assim, separaram por “sorting”, diferentes clones com atividade supressora antígeno-específica de GAD65, 24 deles, de um total de 329, apresentando alta expressão de CD52 (Figura).

Essas células suprimiram a resposta proliferativa de células TCD4 autólogas específicas para TT que haviam sido previamente geradas a partir de um ensaio de proliferação com o TT e posterior sorting das células que respondiam. As células CD4+CD52hi específicas para GAD65 também produzem IL-17 em resposta a estimulação antigênica, e possuem uma baixa expressão de CD25, Foxp3 e CTLA4 que não é diferente daquela observada nas células CD4+CD52lo, mas expressam mais IL-17R, GITR, CD127 e CD24.

Por outro lado, as células CD4+CD45RA+D25+(rTreg) e CD4+CD45RO+D25+ (aTreg), não diferem quanto a sua expressão de CD52, quando comparadas às células CD4 naives ou ativadas. Além disso, o pre-tratamento com anticorpos anti-CD25 não prejudicou a geração das células supressoras CD4+CD52hi. Ainda, a análise de metilacão da região promotora do gene de Foxp3, mostrou diferenças importantes entre estas células e as rTreg

Essas células poderiam estar implicadas na patogênese da diabetes, como já tinhas ido sugerido previamente  pelos autores (2), e confirmado por experimentos do presente trabalho, onde PBMC de pacientes com DM tipo 1 mas (não com DM tipo 2), apresentam deficiência nesta população de células. Ainda, a injeção intravenosa de células CD45+CD52hi retrasa o desenvolvimento de diabetes em um modelo de camundongos RIP.B7/NOD.SCID, que expressam constitutivamente CD80 nas células beta pancreáticas. Não assim a transferência de células depletadas de CD4+CD52hi, que acelerou o desenvolvimento da doença. E este fenótipo se repete em camundongos NOD irradiados que receberam as mesmas células.

Experimentos posteriores mostraram que é o CD52 solúvel (e não o contato entre as células supressoras e as efetoras), que inibe a ativação de células T, por inibir a fosforilação de ZAp70 e lck, proteínas chave do complexo TCR. O efeito é dependente do Siglec-10, uma vez que o tratamento prévio com anticorpos específicos para este receptor inibe o efeito supressor do CD52 solúvel. Como também inibe esse efeito, a modificação estrutural dos carbo-hidratos presentes no CD52 (tratamento prévio do CD52 recombinante solúvel com PNGase ou neuraminidase) .

Neste caso as implicações terapêuticas tal vez sejam aprendidas de forma inversa, uma vez que já existe no mercado um medicamento especifico para inibir o CD52 (usado na terapia de LMC), o uso deste medicamento poderia levar ao desenvolvimento de doenças autoimune, o que de fato está demonstrado nos estudos aleatorizados com alemtuzumab (3). Por outro lado, a terapia com agonistas poderia ser promissória, em casos de DM de tipo 1 pelo menos...

O estado de demetilação da região CNS2 do gene FOXP3 regula o fenótipo das nTreg

Há um certo tempo comentei aqui sobre alguns trabalhos que abordavam o grau de acetilação de algumas regiões genicas relacionadas com o Foxp3 e como isso afetava o funcionamento das Treg. (1)
Mais tarde, vimos que alguns estudos com abordagem genômica ampla permitiram identificar associações entre FOxp3 e outras regiões genicas, bem como confirmar o papel de alguns genes importantes na regulação das Treg (2). Inclusive, foi comentado aqui no Blog o papel da epigenética na funcionalidade das células T. (3).


Para complementar esses conceitos, uma revisão (3) publicada agora em Março 21 na Immunity, vem discutir os diferentes mecanismos de regulação epigenética que participam na definição do fenótipo das nTreg e das iTreg, que diferenciam estas células das Tconv.  Alguns trabalhos anteriores, mediante análises genômicas, vêm mostrando várias regiões que apresentam padrões de metilação do DNA ou de modificação das histonas que são diferenciais entre Tconv e células Treg em humanos e camundongos. Estes padrões encontram-se inclusive em regiões não codificantes, como é o caso do Foxp3 conserved noncoding sequence 2 (CNS2), que apresenta uma baixa metilação em nTreg, e que poderia ser determinante pela persistência do fenótipo regulador dessas células (Figura).

Seria interessante ver se os diferentes medicamentos que têm mostrado potenciar/induzir a diferenciação de células Tconv em Treg, agem na metilação/ demetilação dessas regiões do Foxp3, e de que maneira.

Significado funcional de algumas mudanças epigenéticas em Treg. A hipo metilação de DNA foi observada na região CNS2 do gene Foxp3 em células nTreg. Nessa região, vários factores de transcrição (incluindo Ets1, CREB, e o proprio Foxp3) são montados para ativar a expressão Foxp3, independentemente dos estímulos extracelulares, tais como TGF-b. Por outro lado, para as células iTreg, induzidas por TGF-b in vitro, A hipo metilação do DNA não ocorre na região CNS1 nem na região CNS2, já no caso da modificação H3K4me3 da histona, ela é aumentada na região CNS1, onde o Smad3 se localiza e ativa a expressão Foxp3. Após a remoção do TGF-b, porém, a expressão de Foxp3 não é mantida nestas células iTreg. Immunity, Volume 38, Issue 3, 414-423, 21 March 2013.

Células T reguladoras na era pós genômica

As células T reguladoras têm sido amplamente estudadas em diferentes contextos e seu papel no controle da resposta imune em humanos e camundongos é claro. O mecanismo de funcionamento do fator de transcrição FOXP3 (principal indutor de sua atividade), no entanto, é menos claro, parecendo ser um pouco diferente em humanos do que tem sido observado em camundongos.

Sabe-se que FOXP3 pode interagir com outros fatores de transcrição, aos quais principalmente suprime sua ativação (1, revisado aqui), levando a uma diversidade de populações de Treg, com atividade supressora capaz de manter a homeostase em diferentes contextos inflamatórios (2).

Interação de FOXP3 com outros fatores de transcrição, e seu papel na atividade das Treg. (From: Y Gao et. al. Genes and Immunity (2012) 13, 1-13)

Complicado? Espera só.

A pesquisa em células Treg tem acompanhado as tendências de observação ampla de coisas, algumas já comentadas aqui no blog (3, 4) levando à obtenção de toneladas de dados, que em todo caso ajudam a corroborar (ou não...) observações anteriores, e propor novos conceitos e linhas de pesquisa, mesmo que às vezes a comunidade científica demore (porém cada vez menos) em digerir a quantidade de informação obtida neste tipo de estudos (não assim a indústria, mas isso e outro assunto).

Em um artigo publicado recentemente por Simon Barry e colaboradores na Journal of Immunology (5), em que os pesquisadores fizeram um escrutínio de genoma completo em nTreg isoladas e expandidas de sangue de cordão umbilical humano para identificar sítios de ligação do FOXP3 com outros genes mediante arranjos de imunoprecipitação da cromatina, os autores identificaram muitas! coisas novas. Vou ver se consigo passar a mensagem.

Primeiro, eles encontraram 8308 regiões genômicas únicas (7012 delas associadas a genes, 5579 com pelo menos uma região de interação com o FOXP3), onde potencialmente poderia agir o FOXP3, diretamente com a seguinte sequencia alvo: [(A/G)(C/T)(A/C)AA(C/T)A]. (encontrada usando o algoritmo bioinformático WEEDER).

Como esperado, estes genes estão envolvidos na proliferação, ativação e controle da morte celular em linfócitos T durante a resposta imune e também em doenças inflamatórias e autoimunes. Também houve representação nesses genes alvo, de moléculas envolvidas na resposta a sinalização pelo TCR e citocinas imunomoduladoras, fatores de crescimento, e fatores de transcrição como AP-1, BCL6, HAML (família Runx), HNF1, MYBL, NFAT, OVOL, PAX2, PRDF (família PRDM1/Blimp1), e STAT5.

Além disso,  foram encontrados sítios de interação do FOXP3 com regiões codificadoras para os miR: mir-155, mir-21, mir-22, e mir-142.

O peptidase inhibitor 16 (PI16) foi encontrado expresso de maneira predominante nas nTreg e não nas células T efetoras, e portanto foi proposto como um novo marcador fenotípico de superfície para as células nTreg, confirmando estudos prévios que propunham este marcador.

Os autores ainda comparam a expressão desses genes em nTreg em repouso ou ativadas... e depois comparam o genoma de nTreg murinas com o de nTreg humanas, mostrando pelo menos 4037 genes que estavam diferencialmente associados á região de ligação do FOPX3 entre humano e murino, com uma interseção de “apenas” 888 genes alvo. 

Este trabalho vem complementar alguns estudos sobre alvos da ação do FOXP3, feitos anteriormente com Treg de Camundongos e humanos (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ), e aportar informação sobre o cada vez mais complicado e amplo mecanismo de regulação da imunidade exercido pelas Treg. 

O seu Foxp3 está acetilado o suficiente?

A expansão ex-vivo das células T reguladoras (Treg) a partir de amostras de sangue periférico com o objetivo de transferi-las posteriormente em pacientes que sofrem diversas doenças inflamatórias seria uma maneira muito interessante (tal vez dentre as mais desejadas atualmente) de utilizar o potencial imuno-modulador destas células (1).

Na carreira por entender o funcionamento destas células, várias dificuldades tem surgido para os pesquisadores (veja os posts previos sobre Tregs aqui). Além da conhecida procura por um marcador adequado para a separação específica de células Treg intatas (que gerou varias discussões interessantes no passado, e que ainda continua a gerar), e da mais recentemente aparição de vários subtipos de Treg e de outras populações celulares com funções supressoras diversas, existe outra dificuldade muito importante para alcançar esse propósito de ter uma infusão de Treg pronta: Como enriquecer uma cultura com células Treg principalmente. Isto é, como fazer com que uma porcentagem muito grande das células que se pretende transfundir seja Treg.

A acetilação de resíduos de lisina é uma modificação pós-traducional sofrida pelo foxp3 que foi descrita há certo tempo. Este processo de acetilação de resíduos de lisina e arginina presentes em histonas (proteínas responsáveis por manter a estrutura do DNA) é crítico para a regulação da expressão gênica. Agora sabe-se também que a acetilação é capaz de regular a função de fatores de transcrição com funções no sistema imune, como o foxp3 e fatores que induzem sua expressão (como NF-Kbp65, smad3, stat5). A acetilação do foxp3 torna esta molécula menos suscetível a ser degradada pelo proteassoma, e ao mesmo tempo potencia sua atividade sobre a expressão de outros genes. 

Entao, para obter uma maior proporção de Treg na sua cultura celular (e com maior potencia supressora), adicione um inibidor da deacetilase apropriada (como a Tricostatina). Ou trate o indivíduo com o inibidor da deacetilase para induzir tal efeito já in vivo (2, 3).

Não é tão simples assim, pois a lista de alvos e efeitos moleculares da acetilacao está crescendo contínuamente. Um fato curioso é o recorrente vínculo entre a resposta ao estresse, regulação metabólica e a regulação da resposta imune. Por falar um exemplo, a sirt-1, uma deacetilase pertencente à família das sirtuins (dependentes de NAD) é crucial na manutenção do funcionamento de foxp3 (4-7), e está envolvida na indução de obesidade entre outras funções (8).

Contudo, esses estudos constituem avanços no entendimento do funcionamento do foxp3 e das Treg, abrindo novas possibilidades terapéuticas para doenças inflamatórias e neoplásicas, entre outras.

Referencias

1. Brunstein CG et al., Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics, Blood 117, 3 (Oct 2010): 1061-1070.
2. Wang L, Tao R, Hancock WW. Using histone deacetylase inhibitors to enhance Foxp3(+) regulatory T-cell function and induce allograft tolerance. Immunol. Cell Biol. 2009 Abr;87(3):195-202.
3. Moon C, Kim SH, Park KS, Choi BK, Lee HS, Park JB, et al. Use of epigenetic modification to induce FOXP3 expression in naïve T cells. Transplant. Proc. 2009 Jun;41(5):1848-1854.
4. van Loosdregt J, Brunen D, Fleskens V, Pals CEGM, Lam EWF, Coffer PJ. Rapid Temporal Control of Foxp3 Protein Degradation by Sirtuin-1. PLoS ONE. 2011 Abr;6(4):e19047.
5. Beier UH, Akimova T, Liu Y, Wang L, Hancock WW. Histone/protein deacetylases control Foxp3 expression and the heat shock response of T-regulatory cells. Curr Opin Immunol [Internet]. 2011 Jul 26.
6. van Loosdregt J, Vercoulen Y, Guichelaar T, Gent YYJ, Beekman JM, van Beekum O, et al. Regulation of Treg functionality by acetylation-mediated Foxp3 protein stabilization. Blood. 2010 Feb 4;115(5):965-974.
7. Beier UH, Wang L, Bhatti TR, Liu Y, Han R, Ge G, et al. Sirtuin-1 targeting promotes Foxp3+ T-regulatory cell function and prolongs allograft survival. Mol. Cell. Biol. 2011 Mar;31(5):1022-1029.
8. Clark SJ, Falchi M, Olsson B, Jacobson P, Cauchi S, Balkau B, et al. Association of Sirtuin 1 (SIRT1) Gene SNPs and Transcript Expression Levels With Severe Obesity. Obesity. 2011 Jul 14.

Quer controlar o HIV? Nuntium necare

Há um provérbio latim que diz o oposto do título do nosso post de hoje. Ne nuntium necare. Não mate o mensageiro. Aquele carinha que leva e traz as mensagens entre dois protagonistas de uma guerra. Essa profissão de mensageiro de guerra nunca foi das mais invejadas ou disputadas. Na antiguidade, muitas vezes sobrava mesmo para o mensageiro, quando a notícia transmitida de nada agradava um dos lados em pé de guerra. Nos meios corporativos, até hoje isso se repete, que diga o Julian Assange, criador do site de vazamento de informações confidenciais Wikileaks, ao ser preso em Londres no final do ano passado (veja uma das notícias da prisão aqui). Quando preso, Assange disse algo como “não mate o mensageiro por revelar verdades desconfortáveis”. Bem, o negócio de retaliar o mensageiro é bastante tentador a depender da mensagem transmitida. Isso parece óbvio. Há quem trace um paralelo entre esse provérbio na guerra, na política e ... na imunologia. Um editorial da Nature Medicine lembrou este provérbio ao referir os achados de um novo estudo em HIV (veja o editorial aqui). O grupo liderado pela Helen Horton, do Seattle Biomedical Research Institute (Seatle Biomed), publicou um paper recentemente mostrando que células T CD8+ específicas para o HIV podem proteger através da destruição de células T reguladoras (veja o paper aqui). O racional para o estudo é que certos alelos de MHC são associados com melhores desfechos clínicos, e que isso se relaciona com a ocorrência de intensas respostas de células T CD8+ específicas para o HIV. Esses indivíduos são conhecidos como HIV controllers, elite controllers, elite suppressors ou ainda long-term nonprogressors. Nesses indivíduos, a replicação do HIV é suprimida de tal maneira que a viremia fica abaixo do limite de detecção dos ensaios clínicos (caso esteja curioso, veja uma revisão sobre esse assunto aqui). Os mecanismos imunológicos envolvidos nesse controle da replicação viral ainda não é bem compreendido, e alguns estudos sugerem que alguns alelos de MHC do tipo I, tais como o HLA-B*57 e o HLA-B*27 são bastante prevalentes nesses indivíduos controladores. Bem, a gente já sabe há algum tempo que sabe que moléculas de MHC do tipo I apresentam antígenos às Celulas T CD8+, e que estas células são importantes são importantes para o controle da replicação viral. O que não se sabe ainda é porque alguns alelos de MHC I são mais associados à respostas CD8+ efetivas e controle viral do que outros.

O grupo da Helen Horton focou o estudo na correlação com as células T CD4+ reguladoras, aquelas que modulam as respostas imunes através da inibição das respostas T efetoras. A ação supressora das repostas realizada pelas Tregs é bem importante para reduzir inflamação crônica ou prevenir autoimunidade. Em alguns contextos, como infecção, as Tregs podem favorecer o patógeno através da redução das respostas efetoras protetoras. Na verdade isso é bem mais complexo e tem haver com o balanço entre a quantidade e qualidade das células efetoras e células reguladoras e existe uma farta literatura para matar a curiosidade dos interessados. Uma das moléculas usadas para essa regulação negativa das Tregs é a galectin-9, que se liga à Tim-3, uma molécula inibitória presente nas células T efetoras. Pronto, vamos deixar de embromação e ver de vez como esses assuntos foram amarrados no paper. Os autores mostram que células TCD8+ que reconhecem antígenos apresentados pelos alelos HLA-B*57 e HLA-B*27 são muito mais resistentes à supressão pelas Tregs do que as suas irmãs que reconhecem antígenos apresentados por outros alelos de MHC I. Os caras vão adiante e explicam que esse fenômeno tem haver com o fato de que as células TCD8+ restritas aos alelos supracitados expressam níveis de moléculas Tim-3 substancialmente mais baixos do que as células que reconhecem outros alelos. Para confirmar os achados, os autores mostram que o bloqueio da interação entre Tim-3 e galectina-9 resulta na diminuição da supressão mediada pelas Tregs sobre células T CD8+ que reconhecem outros alelos de MHC I. E o que essa história toda tem haver com o provérbio latim? Ao não serem suprimidas, as T CD8+ acabam causando apoptose das Tregs por citotoxicidade. A matança das Tregs reduz o efeito supressor sobre as células anti-virais efetoras. Ao matar o mensageiro, os portadores dos alelos HLA-B*57 e HLA-B*27 acabam por controlar melhor a replicação viral e ganham uma vantagem nessa guerra imunológica. Além de trazer uma explicação plausível para o entendimento das razões que levam ao controle do HIV por certas pessoas, o estudo ainda traz o bloqueio do Tim-3 como possível abordagem terapêutica. Com a ressalva de que essa estratégia deve ser estudada com calma, para não expor os pacientes ao risco de desenvolvimento de doenças autoimunes. Me parece que a guerra pelo controle da pandemia do HIV no futuro terá menos mensageiros.

Vitamina D e resposta Th2

O papel das vitaminas sobre o sistema imune tem sido tratada no SBlogI (aqui) , em especial a Vitamina D já foi implicada na maturação da avidez do linfócito T e teve o seu receptor relacionado com resistência à infecção. Recentemente, o Journal of Clinical Investigation publicou um trabalho que mostra que a Vitamina D3 atenua a resposta Th2 em pacientes (Vitamin D₃ attenuates Th2 responses to Aspergillus fumigatus mounted by CD4⁺ T cells from cystic fibrosis patients with allergic bronchopulmonary aspergillosis; doi:10.1172/JCI42388). 

A maioria dos indivíduos quando exposta a alérgenos ambientais não desenvolve uma sensibilização Th2, contudo alguns indivíduos apresentam uma forte resposta Th2. O mesmo grupo da publicação em análise, mostrou que células Treg CD4⁺Foxp3⁺ que expressam TGF-β na membrana são críticas para manutenção da tolerância (Ostroukhova M, Qi Z, Oriss TB, Dixon-McCar- thy B, Ray P, Ray A. Treg-mediated immunosuppression involves activation of the Notch-HES1 axis by membrane-bound TGF-beta. J Clin Invest. 2006;116 (4):996–1004).  

No homem, uma manifestação de perda de tolerância no pulmão é o desenvolvimento de aspergilose broncopulmonar alérgica (ABPA) que ocorre em pacientes com fibrose cística. 

Porque o fungo se instala em pacientes com fibrose cística? Esta enfermidade resulta de mutações num canal de anion da membrana plasmática de células epiteliais o que leva a que o epitélio respiratório tenha deficiência na proteção mucociliar. Deste defeito se aproveitam bactérias, como a Pseudomonas aeruginosa, e fungos como o Aspergillus fumigatus. O Aspergillus fumigatus ocorre em cerca de 50% dos pacientes com fibrose cística, mas a ABPA ocorre em 4 a 15% destes pacientes. A ABPA é causada por uma resposta com predominância Th2 contra os antígenos do Aspergillus fumigatus o que sugere que outros fatores, além do defeito mucociliar participam da ABPA nos pacientes com fibrose cística.

O foco do trabalho foi justamente entender o controle tolerância vs alergia nos pacientes com fibrose cística. Foram estudados dois grupos de pacientes com fibrose cística, um com ABPA e outro sem, para testar a hipótese que a sensibilização Th2 é controlada pelo TSLP epitelial. Já foi mostrado que a thymic stromal lymphopoietin (TSLP) aumenta a diferenciação Th2. Adicionalmente, a TSLP pode induzir o ligante de OX40 (OX40L) em células dendríticas (DC, mantenho assim para não confundir com CD de cluster differentiation) e OX40L está relacionado com inflamação no pulmão. Assim, foi também avaliado o papel de OX40L nas respostas de pacientes com ABPA. Finalmente, foram também avaliadas as células T Foxp3+ CD4+ para testar a hipótese que os pacientes com colonização pelo A. fumigatus sem ABPa têm maior frequência de Tregs em resposta à estimulação por A. fumigatus e que estas células suprimem a resposta Th2 destes indivíduos. 

“Here, we show that TSLP induced potent Th2-skewing activity by CD11c⁺ DCs from ABPA patients, which was dependent on OX40L. Furthermore, we discovered that ABPA correlated with vitamin D deficiency, and supplementation with vitamin D potentiated Treg-mediated regulation of Th2 reactivity. These data support the development of a clinical trial of vitamin D to prevent or treat ABPA in CF and other Th2-related diseases.”

A dose ideal de Vitamina D é muito difícil de ser obtida apenas com uma dieta normal e esta ausente do leite materno. Ela é mais um hormonio que uma vitamina já que seu precursor é encontrado na pele e naturalmente produzido no organismo. Ao sofrer a ação da luz UV (da luz do sol, por exemplo) o precursor é convertido numa molecula que pela circulação chega ao fígado. Aí se transforma num prohormônio que nos rins pode ser convertido na Vitamina D.

Ilustrações:

Vitamina D;

Metabolismo da Vitamina D;

Histopatologia da aspergilose.