Células T reguladoras promovem Artrite Autoimune

Figura: Condições inflamatórias durante a artrite convertem a subpopulação de células T Foxp3+ em células TH17 patogênicas. Komatsu e colaboradores identificaram uma subpopulação de células Treg Foxp3+CD25low que perde a expressão de Foxp3 durante a artrite autoimune. Interleucina-6 secretada por fibroblastos sinoviais induz a conversão desta subpopulação de células Treg em células Th17 patogênicas que, por sua vez, induzem mais liberação de IL-6, através da secreção de IL-17. Como fibroblastos e osteoblastos, células Th17 derivadas de células Foxp3+ podem produzir altos níveis de RANKL, que diretamente promove osteoclastogênese e destruição óssea. Fonte: Joller & Kuchroo, 2014-Nature Medicine.

Doenças autoimunes são frequentemente resultado de um desbalanço entre células T reguladoras (Treg) e células Th17 produtoras de IL-17. A origem das células Th17 ainda permanece desconhecida. Já Foxp3 é indispensável para a função supressora de células Treg, sendo a estabilidade de sua expressão nas células amplamente estudada. Na maioria das circunstâncias, células T reguladoras Foxp3+ são uma população de células T estáveis para manutenção da auto-tolerância. 

Estudo recente publicado na Revista Nature Medicine liderado pelos grupos dos Drs. Hiroshi Takayanagi da Universidade de Tóquio e Jeffrey Bluestone da Universidade da Califórnia mostrou que o microambiente inflamatório na artrite autoimune induz a conversão de uma subpopulação de células T Foxp3+ em células produtoras de IL-17 que contribuem para a patogênese da doença.

Durante a artrite autoimune, células T CD4+Foxp3+CD25low perdem a expressão de Foxp3 (células exFoxp3) e sofrem trans-diferenciação em células Th17. Os dados mostraram que as células exFoxp3 que expressam IL-17 (células Th17 exFoxp3) se acumularam nas juntas inflamadas. A conversão de células T CD4+Foxp3+ em células Th17 foi mediada por IL-6 produzida por fibroblastos sinoviais. Além disso, células Th17 exFoxp3 eram células T osteoclastogênicas mais potentes do que células Th17 derivadas de células T CD4+ naive. Células Th17 exFoxp3 apresentavam expressão de Sox4, CCR6, CCL20, receptor de IL-23 e RANKL, também denominada como membro 11 da superfamília de ligantes do fator de necrose tumoral (TNFS11).

A transferência adotiva de células T CD4+Foxp3+CD25low autoreativas em camundongos seguida pela imunização secundária com colágeno acelerou o início e aumento da gravidade da artrite e estava associada também com a perda da expressão de Foxp3 na maioria das células T transferidas. Além disso, foram observadas células T Foxp3+IL-17+ na sinóvia de pacientes portadores de artrite reumatoide ativa, o que sugere que células T Foxp3 plásticas contribuem para a patogênese da doença. Esses achados estabelecem a importância e contribuição da instabilidade de Foxp3 na geração de células Th17 patogênicas na autoimunidade.

Referências

- Komatsu N, Okamoto K, Sawa S, Nakashima T, Oh-Hora M, Kodama T, Tanaka S, Bluestone JA, Takayanagi H. Pathogenic conversion of Foxp3(+) T cells into TH17 cells in autoimmune arthritis. Nat Med. 2014 Jan;20(1):62-8. doi: 10.1038/nm.3432. Epub 2013 Dec 22.

- Joller N, Kuchroo VK. Good guys gone bad: exTreg cells promote autoimmune arthritis. Nat Med. 2014 Jan 7;20(1):15-7. doi: 10.1038/nm.3439.

Células T reguladoras na era pós genômica

As células T reguladoras têm sido amplamente estudadas em diferentes contextos e seu papel no controle da resposta imune em humanos e camundongos é claro. O mecanismo de funcionamento do fator de transcrição FOXP3 (principal indutor de sua atividade), no entanto, é menos claro, parecendo ser um pouco diferente em humanos do que tem sido observado em camundongos.

Sabe-se que FOXP3 pode interagir com outros fatores de transcrição, aos quais principalmente suprime sua ativação (1, revisado aqui), levando a uma diversidade de populações de Treg, com atividade supressora capaz de manter a homeostase em diferentes contextos inflamatórios (2).

Interação de FOXP3 com outros fatores de transcrição, e seu papel na atividade das Treg. (From: Y Gao et. al. Genes and Immunity (2012) 13, 1-13)

Complicado? Espera só.

A pesquisa em células Treg tem acompanhado as tendências de observação ampla de coisas, algumas já comentadas aqui no blog (3, 4) levando à obtenção de toneladas de dados, que em todo caso ajudam a corroborar (ou não...) observações anteriores, e propor novos conceitos e linhas de pesquisa, mesmo que às vezes a comunidade científica demore (porém cada vez menos) em digerir a quantidade de informação obtida neste tipo de estudos (não assim a indústria, mas isso e outro assunto).

Em um artigo publicado recentemente por Simon Barry e colaboradores na Journal of Immunology (5), em que os pesquisadores fizeram um escrutínio de genoma completo em nTreg isoladas e expandidas de sangue de cordão umbilical humano para identificar sítios de ligação do FOXP3 com outros genes mediante arranjos de imunoprecipitação da cromatina, os autores identificaram muitas! coisas novas. Vou ver se consigo passar a mensagem.

Primeiro, eles encontraram 8308 regiões genômicas únicas (7012 delas associadas a genes, 5579 com pelo menos uma região de interação com o FOXP3), onde potencialmente poderia agir o FOXP3, diretamente com a seguinte sequencia alvo: [(A/G)(C/T)(A/C)AA(C/T)A]. (encontrada usando o algoritmo bioinformático WEEDER).

Como esperado, estes genes estão envolvidos na proliferação, ativação e controle da morte celular em linfócitos T durante a resposta imune e também em doenças inflamatórias e autoimunes. Também houve representação nesses genes alvo, de moléculas envolvidas na resposta a sinalização pelo TCR e citocinas imunomoduladoras, fatores de crescimento, e fatores de transcrição como AP-1, BCL6, HAML (família Runx), HNF1, MYBL, NFAT, OVOL, PAX2, PRDF (família PRDM1/Blimp1), e STAT5.

Além disso,  foram encontrados sítios de interação do FOXP3 com regiões codificadoras para os miR: mir-155, mir-21, mir-22, e mir-142.

O peptidase inhibitor 16 (PI16) foi encontrado expresso de maneira predominante nas nTreg e não nas células T efetoras, e portanto foi proposto como um novo marcador fenotípico de superfície para as células nTreg, confirmando estudos prévios que propunham este marcador.

Os autores ainda comparam a expressão desses genes em nTreg em repouso ou ativadas... e depois comparam o genoma de nTreg murinas com o de nTreg humanas, mostrando pelo menos 4037 genes que estavam diferencialmente associados á região de ligação do FOPX3 entre humano e murino, com uma interseção de “apenas” 888 genes alvo. 

Este trabalho vem complementar alguns estudos sobre alvos da ação do FOXP3, feitos anteriormente com Treg de Camundongos e humanos (6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13 ), e aportar informação sobre o cada vez mais complicado e amplo mecanismo de regulação da imunidade exercido pelas Treg. 

Células iTreg surgiram para proteger o feto

A gestação é um transplante semi-alogênico natural. Durante a gestação, o sistema imune materno enfrenta o grande desafio de tolerar o feto, que expressa potentes antígenos de histocompatibilidade estranhos. Um novo estudo mostrou que esta é uma função para as células T regulatórias induzidas (iTreg), e mais: que esta função parece ter sido a própria razão evolutiva do aparecimento destas células.

(Samstein RM, Josefowicz SZ, Arvey A, Treuting PM, Rudensky AY. Extrathymic generation of regulatory T cells in placental mammals mitigates maternal-fetal conflict. Cell. 150: 29-38, 2012)

Três sequências de DNA de elementos “enhancer”, identificadas como CNS1, CNS2 e CNS3, estão localizadas contíguas ao gene foxp3, responsável pelo fator de transcrição Foxp3. CNS1 contém sítios de ligação para proteínas Smad, e desta forma, confere responsividade de foxp3 ao TGF-beta, (já que este atua através de proteínas Smad). Animais deficientes de CNS1 não formam células iTreg, apesar de formarem células nTreg (derivadas do timo) normalmente. Neste trabalho, os autores acasalaram fêmeas selvagens ou deficientes de CNS1 com machos singênicos e alogênicos, e mediram o efeito na prole. Houve perda e reabsorção de fetos semi-alogênicos quando as mães eram deficientes de CNS1, mas não houve qualquer problema com a geração de fetos singênicos. Estes dados correlacionaram com a presença de células iTreg. Células iTreg apareceram normalmente na decídua placentária de fêmeas selvagens, mas estavam ausentes nas fêmeas deficientes para CNS1. Os dados indicam que as células iTreg suprimiram a resposta imune contra os fetos semi-alogênicos, permitindo o sucesso da gestação.

CNS1 faz parte de um retrotranposon, isto é, provavelmente foi inserido durante a evolução. Além disso, a análise filogenética da expressão de CNS1 mostrou que este enhancer surge de repente, e apenas em mamíferos eutérios, isto é, está relacionado com a placentação. Estes dados sugerem que a manutenção completa da gestação pode mesmo ser a causa evolutiva para o aparecimento das células iTreg, células capazes de suprimir a alorreatividade contra os antígenos de histocompatibilidade paternos expressos pelo feto (ver Figura). De acordo com esta hipótese, a função regulatória exercida pelas células iTreg nas superfícies mucosas, pode ter sido uma adaptação mais tardia da função primordial “pró-gravidez” destas células. A descoberta desta origem evolutiva das células iTreg traz esperanças de que elas possam ser utilizadas com sucesso para prevenir a rejeição de transplantes.

Figura. A. O timo forma duas populaçãoes de células T, as células Treg naturais (denominadas tTreg nesta figura), que são Foxp3 positivas, e as células T convencionais, que são Foxp3 negativas. B. No entanto, na periferia de mamíferos eutérios, células T convencionais respondem a sinais de TGF-beta, induzindo a expressão de Foxp3 e formando células Treg induzidas (denominadas pTreg nesta figura). Para isto, a expressão do enhancer de foxp3 CNS1, que liga proteínas Smad, é necessária. C. A previsão deste trabalho é que em vertebrados não-eutérios, as células iTreg não existam. Figura retirada de: Gobert M, Lafaille JJ. Maternal-fetal immune tolerance, block by block. Cell. 150: 7-9, 2012.

Post de George A. DosReis

O seu Foxp3 está acetilado o suficiente?

A expansão ex-vivo das células T reguladoras (Treg) a partir de amostras de sangue periférico com o objetivo de transferi-las posteriormente em pacientes que sofrem diversas doenças inflamatórias seria uma maneira muito interessante (tal vez dentre as mais desejadas atualmente) de utilizar o potencial imuno-modulador destas células (1).

Na carreira por entender o funcionamento destas células, várias dificuldades tem surgido para os pesquisadores (veja os posts previos sobre Tregs aqui). Além da conhecida procura por um marcador adequado para a separação específica de células Treg intatas (que gerou varias discussões interessantes no passado, e que ainda continua a gerar), e da mais recentemente aparição de vários subtipos de Treg e de outras populações celulares com funções supressoras diversas, existe outra dificuldade muito importante para alcançar esse propósito de ter uma infusão de Treg pronta: Como enriquecer uma cultura com células Treg principalmente. Isto é, como fazer com que uma porcentagem muito grande das células que se pretende transfundir seja Treg.

A acetilação de resíduos de lisina é uma modificação pós-traducional sofrida pelo foxp3 que foi descrita há certo tempo. Este processo de acetilação de resíduos de lisina e arginina presentes em histonas (proteínas responsáveis por manter a estrutura do DNA) é crítico para a regulação da expressão gênica. Agora sabe-se também que a acetilação é capaz de regular a função de fatores de transcrição com funções no sistema imune, como o foxp3 e fatores que induzem sua expressão (como NF-Kbp65, smad3, stat5). A acetilação do foxp3 torna esta molécula menos suscetível a ser degradada pelo proteassoma, e ao mesmo tempo potencia sua atividade sobre a expressão de outros genes. 

Entao, para obter uma maior proporção de Treg na sua cultura celular (e com maior potencia supressora), adicione um inibidor da deacetilase apropriada (como a Tricostatina). Ou trate o indivíduo com o inibidor da deacetilase para induzir tal efeito já in vivo (2, 3).

Não é tão simples assim, pois a lista de alvos e efeitos moleculares da acetilacao está crescendo contínuamente. Um fato curioso é o recorrente vínculo entre a resposta ao estresse, regulação metabólica e a regulação da resposta imune. Por falar um exemplo, a sirt-1, uma deacetilase pertencente à família das sirtuins (dependentes de NAD) é crucial na manutenção do funcionamento de foxp3 (4-7), e está envolvida na indução de obesidade entre outras funções (8).

Contudo, esses estudos constituem avanços no entendimento do funcionamento do foxp3 e das Treg, abrindo novas possibilidades terapéuticas para doenças inflamatórias e neoplásicas, entre outras.

Referencias

1. Brunstein CG et al., Infusion of ex vivo expanded T regulatory cells in adults transplanted with umbilical cord blood: safety profile and detection kinetics, Blood 117, 3 (Oct 2010): 1061-1070.
2. Wang L, Tao R, Hancock WW. Using histone deacetylase inhibitors to enhance Foxp3(+) regulatory T-cell function and induce allograft tolerance. Immunol. Cell Biol. 2009 Abr;87(3):195-202.
3. Moon C, Kim SH, Park KS, Choi BK, Lee HS, Park JB, et al. Use of epigenetic modification to induce FOXP3 expression in naïve T cells. Transplant. Proc. 2009 Jun;41(5):1848-1854.
4. van Loosdregt J, Brunen D, Fleskens V, Pals CEGM, Lam EWF, Coffer PJ. Rapid Temporal Control of Foxp3 Protein Degradation by Sirtuin-1. PLoS ONE. 2011 Abr;6(4):e19047.
5. Beier UH, Akimova T, Liu Y, Wang L, Hancock WW. Histone/protein deacetylases control Foxp3 expression and the heat shock response of T-regulatory cells. Curr Opin Immunol [Internet]. 2011 Jul 26.
6. van Loosdregt J, Vercoulen Y, Guichelaar T, Gent YYJ, Beekman JM, van Beekum O, et al. Regulation of Treg functionality by acetylation-mediated Foxp3 protein stabilization. Blood. 2010 Feb 4;115(5):965-974.
7. Beier UH, Wang L, Bhatti TR, Liu Y, Han R, Ge G, et al. Sirtuin-1 targeting promotes Foxp3+ T-regulatory cell function and prolongs allograft survival. Mol. Cell. Biol. 2011 Mar;31(5):1022-1029.
8. Clark SJ, Falchi M, Olsson B, Jacobson P, Cauchi S, Balkau B, et al. Association of Sirtuin 1 (SIRT1) Gene SNPs and Transcript Expression Levels With Severe Obesity. Obesity. 2011 Jul 14.