DockTope: Um portal gratuito e simples para a predição estrutural de complexos peptídeo-MHC

Autor: Dinler Amaral Antunes, Bacharel em Biomedicina pela UFRGS, Mestrado e Doutorado pelo PPGBM/UFRGS e pós-doutorado pela Rice University (Texas/EUA).

    O ancoramento molecular (ou docking) tem sido amplamente utilizado para predizer a estrutura de complexos proteína-ligante, tanto na academia quanto na indústria [1]. Existe uma grande diversidade de programas, oferecendo recursos para abordar diferentes problemas e diferentes níveis de flexibilidade do sistema [2]. Na imunologia, uma das mais interessantes aplicações do docking diz respeito a predição de complexos peptideo-MHC de classe I (pMHC-I) [3,4], um componente central para a resposta imunológica celular. Esta aplicação, no entanto, não é trivial.

    Para predizer a conformação mais provável de um ligante na fenda do receptor o programa de docking deve explorar todas as ligações flexíveis do ligante, bem como movimentos de rotação e translação. Na maioria dos casos o docking é aplicado para ligantes pequenos (até 10 ligações flexíveis), sendo que a acurácia e a performance das predições decai com o aumento da flexibilidade do ligante [5,6]. Ligantes peptídicos representam um desafio particular para o docking, uma vez que apresentam uma cadeia principal bastante flexível e cadeias laterais que podem também adotar uma diversidade de conformações. Um estudo recente salientou a limitação dos protocolos convencionais na predição estrutural de ligantes peptídicos com até 5 resíduos [7]. Estes dados salientam o enorme desafio referente a aplicação de ferramentas de docking à moléculas de MHC de classe I, uma vez que os ligantes envolvidos são peptídeos contendo entre 8 e 11 resíduos e mais de 35 ligações flexíveis.

    Tendo em vista a importância da análise estrutural de complexos pMHC-I e as limitações dos métodos experimentais para a resolução destas estruturas (sobretudo considerando-se a grande variabilidade deste sistema), diversas abordagens foram propostas para tentar viabilizar a predição estrutural in silico de complexos pMHC-I. Dentre os exemplos mais notáveis, eu saliento o trabalho pioneiro de Andrew Bordner [3,9], bem como as ferramentas DynaPred, MHCsim e pDOCK. Apesar de apresentarem sucesso em casos particulares, estas ferramentas possuem limitações importantes e na maioria dos casos envolvem o uso de diferentes softwares e até mesmo pacotes pagos. O único desta lista que foi disponibilizado na forma de um servidor online foi o MHCsim, que na verdade não realiza a predição por docking, mas apenas converte uma estrutura conhecida (cristal) no complexo de interesse ("mutando" as posições discordantes).

    Em 2010, um grupo da UFRGS publicou um protocolo para a predição estrutural de complexos pMHC-I combinando etapas de docking e minimização de energia [10]. O protocolo foi explicado em um post anterior aqui do blog. Assim como os métodos descritos anteriormente, este protocolo envolve uso de diferentes programas e uma série de etapas de preparação e conversão de arquivos, dificultando seu uso por outros pesquisadores. No entanto, um esforço foi feito para automatizar todas as etapas e implementar o protocolo em um servidor que pudesse ser acessado livremente, sem exigir do usuário qualquer conhecimento de bioinformática. Assim surgiu o DockTope, a nova alternativa para a predição estrutural de complexos pMHC-I. Basta escolher o alelo de MHC de interesse, fornecer a sequência do peptídeo e aguardar o resultado. A técnica depende da utilização de padrões estruturais compartilhados entre peptídeos apresentados por um mesmo alelo de MHC, os quais foram determinados para 4 alelos de MHC até o momento [10]. Apesar de existirem exceções a estes padrões, um artigo publicado recentemente na Scientific Reports demonstrou a robustez do método [4]. A técnica foi empregada na reprodução de 135 estruturas cristalográficas de complexos pMHC-I (não redundantes), apresentando um valor médio de RMSD para todos os átomos do ligante inferior a 2 Å (abaixo da resolução média dos cristais utilizados, Figura 1).

Figura 1. Valores médios de RMSD (Root Mean Square Deviation)
 para as 135 estruturas cristalográficas reproduzidas, considerando-se
carbono alfa (azul) ou todos os átomos do ligante (vermelho). Valores
médios de resolução dos cristais reproduzidos também são
apresentados (verde) para comparação.

    Além do sucesso na reprodução de estruturas cristalográficas, predições baseadas nos modelos gerados foram confirmadas com dados experimentais [11,12,13]. Com base na similaridade estrutural dos modelos de complexos pMHC-I foi possível predizer eventos de reatividade cruzada de linfócitos T, envolvendo peptídeos de diferentes vírus e com baixa similaridade de sequencia [13]. Estes dados reforçam a validade biológica dos modelos gerados, salientando a aplicabilidade deste método para o desenvolvimento de vacinas.

   O DockTope já está sendo aplicado em larga escala para modelar uma série de alvos (principalmente peptídeos virais) os quais estão sendo depositados em um banco de dados desenvolvido pela mesma equipe, o CrossTope [14]. Neste site o usuário pode pesquisar os complexos que já foram modelados e obter informações sobre o receptor e o ligante, bem como links para outros bancos de dados. Também é possível comparar complexos de interesse e observar o potencial eletrostático da superfície de interação com o TCR. Apesar de possibilitar a modelagem de um número restrito de alelos de MHC, o DockTope inclui justamente alelos de elevado interesse para os imunologistas. O HLA-A*02:01 é um dos mais frequentes alelos em humanos [15] e o alelo HLA-B*27:05 foi associado ao controle da infecção por HIV e HCV [16,17,18], bem como a eventos de autoimunidade (ex.: espondilite anquilosante) [19].

Limitações: Conforme mencionado anteriormente, já foram identificados alguns exemplos de exceções aos padrões utilizados para modelar a cadeia principal dos peptídeos [10]. Até o momento não é possível identificar com base na sequência se o alvo de interesse será uma destas exceções, então existe um erro associado a técnica. Este tipo de incerteza é comum a qualquer método de predição e os dados de reprodução de cristais mencionados anteriormente reforçam a ideia de que a técnica é bem sucedida na maioria dos casos, pelo menos para estes alelos (HLA-A*02:01, HLA-B*27:05, H2-Db, H2-Kb). É possível observar na Figura 1 que a média de RMSD das reproduções para HLA-B*27:05 foi mais alta que para os demais alelos, o que salienta a complexidade associada a flexibilidade do ligante. Peptídeos restritos a este alelo apresentam um conteúdo maior de argininas, as quais possuem longas cadeias laterais, sendo particularmente difíceis de predizer com acurácia. Nesta primeira fase, o DockTope não permite que o usuário modele múltiplos alvos ao mesmo tempo, o que dificulta a modelagem de um conjunto grande de complexos. Estas restrições devem ser flexibilizadas em um segundo momento, a medida que for confirmada a demanda pelo serviço. 

Drogas que alteram o “self”

Um estudo recente mostrou que drogas que se ligam a alelos do HLA causam apresentação de novos peptídeos endógenos, ativação policlonal de células T e reações adversas. Drogas como o agente anti-retroviral Abacavir, o anti-epiléptico Carbamazepina, e o anti-uricêmico Alopurinol causam reações de hipersensibilidade de base imunológica, reações que são graves e potencialmente fatais para os pacientes. Estas reações são seletivas para indivíduos que expressam um determinado alelo HLA, mas a base para esta seletividade permanecia sem explicação. No entanto, um estudo recente do grupo de pesquisa australiano liderado por James McCluskey, especializado em biologia estrutural de interações entre MHC e TCR, determinou o mecanismo de ação do Abacavir, iluminando uma área até então obscura da imunologia.

(referência: Patricia T. Illing, Julian P. Vivian, Nadine L. Dudek, Lyudmila Kostenko, Zhenjun Chen, Mandvi Bharadwaj, John J. Miles, Lars Kjer-Nielsen, Stephanie Gras, Nicholas A. Williamson, Scott R. Burrows, Anthony W. Purcell, Jamie Rossjohn & James McCluskey. Immune self-reactivity triggered by drug-modified HLA-peptide repertoire.

Nature(2012)doi:10.1038/nature11147. Published online 23 May 2012.)

Os estudos mostraram que a molécula do Abacavir, que é um análogo de nucleosídeo, se liga de forma não-covalente na fenda ligante de antígeno do alelo HLA-B*57:01. A ligação é altamente específica, não ocorrendo com o alelo relacionado HLA-B*57:03. A ligação modifica a conformação e a química da fenda de ligação de antígeno desta molécula HLA, fazendo com que 20-25% dos peptídeos eluídos desta sejam peptídeos “novos”, que não se ligavam na ausência de Abacavir.

Desta forma, a ligação do Abacavir mimetiza ligações simultâneas de vários antígenos exógenos, causando a ligação de novos peptídeos no HLA: uma multiplicidade de alterações do “self”. A ligação de novos peptídeos causa uma ativação policlonal de células T CD8, com atividade inflamatória e secreção de citocinas, e explicando as manifestações clínicas da reação de hipersensibilidade ao Abacavir. (Ver Figura).

Figura. Mecanismo de ação do Abacavir. Na figura inferior, a droga se liga na fenda do alelo HLA-B* 57:01, mas não em HLA-B*57:03. Esta ligação permite o encaixe de novos peptídeos endógenos, que antes eram incompatíveis com o alelo. A sua ligação irá ativar novas células T CD8 complementares, e provocar a reação de hipersensibilidade. Os autores sugerem que certas moléculas endógenas poderiam fazer o papel do Abacavir, em situações que levam à autoimunidade.

Os pesquisadores mostraram também que o mesmo fenômeno ocorre com a ligação da Carbamazepina a um outro alelo humano, o HLA-B*15:02. Estes estudos fornecem uma base estrutural para entender a alta correlação que existe entre reações de hipersensibilidade a drogas e certos alelos HLA. Interessante, os autores especulam que, se pequenas moléculas análogas a nucleosídeos podem se ligar no HLA e modificar o seu repertório de peptídeos ligantes, um fenômeno parecido envolvendo pequenas moléculas endógenas ligantes, poderia estar envolvido com a indução de autoimunidade. Esta possibilidade merece ser investigada.

Post de George A. DosReis

Quer controlar o HIV? Nuntium necare

Há um provérbio latim que diz o oposto do título do nosso post de hoje. Ne nuntium necare. Não mate o mensageiro. Aquele carinha que leva e traz as mensagens entre dois protagonistas de uma guerra. Essa profissão de mensageiro de guerra nunca foi das mais invejadas ou disputadas. Na antiguidade, muitas vezes sobrava mesmo para o mensageiro, quando a notícia transmitida de nada agradava um dos lados em pé de guerra. Nos meios corporativos, até hoje isso se repete, que diga o Julian Assange, criador do site de vazamento de informações confidenciais Wikileaks, ao ser preso em Londres no final do ano passado (veja uma das notícias da prisão aqui). Quando preso, Assange disse algo como “não mate o mensageiro por revelar verdades desconfortáveis”. Bem, o negócio de retaliar o mensageiro é bastante tentador a depender da mensagem transmitida. Isso parece óbvio. Há quem trace um paralelo entre esse provérbio na guerra, na política e ... na imunologia. Um editorial da Nature Medicine lembrou este provérbio ao referir os achados de um novo estudo em HIV (veja o editorial aqui). O grupo liderado pela Helen Horton, do Seattle Biomedical Research Institute (Seatle Biomed), publicou um paper recentemente mostrando que células T CD8+ específicas para o HIV podem proteger através da destruição de células T reguladoras (veja o paper aqui). O racional para o estudo é que certos alelos de MHC são associados com melhores desfechos clínicos, e que isso se relaciona com a ocorrência de intensas respostas de células T CD8+ específicas para o HIV. Esses indivíduos são conhecidos como HIV controllers, elite controllers, elite suppressors ou ainda long-term nonprogressors. Nesses indivíduos, a replicação do HIV é suprimida de tal maneira que a viremia fica abaixo do limite de detecção dos ensaios clínicos (caso esteja curioso, veja uma revisão sobre esse assunto aqui). Os mecanismos imunológicos envolvidos nesse controle da replicação viral ainda não é bem compreendido, e alguns estudos sugerem que alguns alelos de MHC do tipo I, tais como o HLA-B*57 e o HLA-B*27 são bastante prevalentes nesses indivíduos controladores. Bem, a gente já sabe há algum tempo que sabe que moléculas de MHC do tipo I apresentam antígenos às Celulas T CD8+, e que estas células são importantes são importantes para o controle da replicação viral. O que não se sabe ainda é porque alguns alelos de MHC I são mais associados à respostas CD8+ efetivas e controle viral do que outros.

O grupo da Helen Horton focou o estudo na correlação com as células T CD4+ reguladoras, aquelas que modulam as respostas imunes através da inibição das respostas T efetoras. A ação supressora das repostas realizada pelas Tregs é bem importante para reduzir inflamação crônica ou prevenir autoimunidade. Em alguns contextos, como infecção, as Tregs podem favorecer o patógeno através da redução das respostas efetoras protetoras. Na verdade isso é bem mais complexo e tem haver com o balanço entre a quantidade e qualidade das células efetoras e células reguladoras e existe uma farta literatura para matar a curiosidade dos interessados. Uma das moléculas usadas para essa regulação negativa das Tregs é a galectin-9, que se liga à Tim-3, uma molécula inibitória presente nas células T efetoras. Pronto, vamos deixar de embromação e ver de vez como esses assuntos foram amarrados no paper. Os autores mostram que células TCD8+ que reconhecem antígenos apresentados pelos alelos HLA-B*57 e HLA-B*27 são muito mais resistentes à supressão pelas Tregs do que as suas irmãs que reconhecem antígenos apresentados por outros alelos de MHC I. Os caras vão adiante e explicam que esse fenômeno tem haver com o fato de que as células TCD8+ restritas aos alelos supracitados expressam níveis de moléculas Tim-3 substancialmente mais baixos do que as células que reconhecem outros alelos. Para confirmar os achados, os autores mostram que o bloqueio da interação entre Tim-3 e galectina-9 resulta na diminuição da supressão mediada pelas Tregs sobre células T CD8+ que reconhecem outros alelos de MHC I. E o que essa história toda tem haver com o provérbio latim? Ao não serem suprimidas, as T CD8+ acabam causando apoptose das Tregs por citotoxicidade. A matança das Tregs reduz o efeito supressor sobre as células anti-virais efetoras. Ao matar o mensageiro, os portadores dos alelos HLA-B*57 e HLA-B*27 acabam por controlar melhor a replicação viral e ganham uma vantagem nessa guerra imunológica. Além de trazer uma explicação plausível para o entendimento das razões que levam ao controle do HIV por certas pessoas, o estudo ainda traz o bloqueio do Tim-3 como possível abordagem terapêutica. Com a ressalva de que essa estratégia deve ser estudada com calma, para não expor os pacientes ao risco de desenvolvimento de doenças autoimunes. Me parece que a guerra pelo controle da pandemia do HIV no futuro terá menos mensageiros.

Doença de Parkinson e resposta inflamatória

A inflamação continua a estender os seus mecanismos a áreas pouco prováveis. Um artigo recentemente publicado na Nature Genetics “Common genetic variation in the HLA region is associated with late-onset sporadic Parkinson's disease” (doi:10.1038/ng.642) amplia os achados anteriores ao mostrar o envolvimento do HLA na Doença de Parkinson e mostra que áreas envolvidas na resposta inflamatória se relacionam com o Parkinson de instalação tardia.

A Doença de Parkinson se caracteriza por um comprometimento progressivo do movimento devido a disfunção dos neuronios secretores de dopamina. A Doença afeta os núcleos da base que controlam a transmissão dos comandos conscientes e motores do córtex cerebral para os músculos e leva a disfunções cognitiva e motora. 

A Doença de Parkinson de instalação precoce já foi associada com mutações em diversos gens. Contudo a Doença de instalação tardia era considerada como influenciada por fatores ambientais e com susceptibilidade genética, mas sem um componente genético conhecido.

É interessante salientar que o risco de desenvolvimento da Doença de Parkinson tem uma associação inversa com o tabagismo, o uso de café -com cafeína e com o uso de anti-inflamatórios não-esteroidais.

O estudo envolveu a realização de uma associação genome-wide de 2.000 pacientes com Doença de Parkinson e de 1.986 controles e 811.597 SNPs totais. Os resultados confirmaram algumas associações já mostradas anteriormente e identificaram uma associação nova com o HLA. Esta associação foi uniforme em todos os estratos de risco e genéticos estudados e foi mais forte em rs3129882, uma variante não codificante no HLA-DRA. Dois estudos anteriores já haviam sugerido que rs3129882 influencia a expressão de HLA-DR e HLA-DQ. Além disto, já foi também demonstrado que o cérebro de indivíduos com Parkinson têm aumento da expressão de antígenos DR e mostram micróglia reaiva a DR. Tudo isto reforça que a associação com o HLA dá suporte ao envolvimento do sistema imune na Doença de Parkinson.

“We uncovered a new genetic association with Parkinson's disease in the HLA region (chromosome 6p21.3), which we designated PARK18. The variant most strongly associated with disease was rs3129882 in intron 1 of HLA-DRA. This association was genome-wide significant even after adjusting for the four covariates (sex, age, PC1 and PC2; P = 2.9 × 10⁻⁸;...). One hundred and seven HLA SNPs reached P < 10⁻³ for association with Parkinson's disease. We replicated the association of rs3129882 in two independent datasets (meta-analysis odds ratio (OR) = 1.26, meta-analysis P = 1.9 × 10⁻¹⁰;). The risk allele was the same in all datasets and was in Hardy-Weinberg equilibrium (HWE) in cases and in controls, which, in addition to the visual inspection of intensity plots, supports our belief that there were no major problems with our genotyping. Stratified analysis by family history, age at disease onset, gender and environmental exposures revealed ubiquitous associations across strata, and tests of heterogeneity across strata were not significant.”

Veja o texto completo

A ilustração acima do texto é uma figura do artigo discutido, a ilustração adicional é um esquema dos mecanismos da Doença de Parkinson. 

Alelos de HLA, repertório de células T e imunidade contra o HIV

Um novo estudo baseado em modelagem computacional traz um importante avanço na compreensão de mecanismos imunológicos responsáveis pelo controle da infecção pelo HIV. Andrej Košmrlj e colaboradores (Ragon Institute, MIT e Harvard) tentaram responder uma pergunta simples de resposta até agora pouco conhecida: Por que determinados indivíduos podem controlar a infecção pelo HIV durante longos períodos de tempo sem a terapia anti-retroviral?

Os autores publicaram um paper na Nature no qual afirmam que a expressão do alelo HLA-B57 por esses indivíduos naturalmente imunes ao HIV gera um repertório de células T CD8+ naïve que apresenta uma maior fração de células que reconhecem o vírus. Além disso, essas células apresentam maior reação cruzada para epítopos virais mutantes, o que pode contribuir para um melhor controle do HIV.

A capacidade em relação ao controle da infecção pelo HIV tem sido associada à expressão de determinados alelos HLA-B, por exemplo, HLA-B57 está associado com o controle do vírus, enquanto o HLA-B7 é associado com rápida progressão para a AIDS. Algoritmos que predizem o número de peptídeos do proteoma humano que podem se ligar a esses alelos revelaram que o HLA-B57 liga-se a muito menos peptídeos do que o alelo HLA-B7 (70.000 e 180.000, respectivamente). Isto sugere que as células T restritas ao HLA-B57 encontram menos peptídeos self durante o desenvolvimento do timo.

Com o objetivo de explorar o efeito desta diversidade menor do repertório peptídico no timo sobre as células T maduras, os autores desenvolveram um modelo in silico de seleção tímica em que o número de peptídeos self varia. Em seguida, eles avaliaram a reatividade cruzada das células T selecionadas através da introdução de mutações nos peptídeos virais que sabidamente determinam os resíduos de contato que são importantes para o reconhecimento antigênico. Os cálculos mostraram que um repertório de células T restritas ao HLA-B57 tem mais células T que reconhecem peptídeos virais do que um repertório de células T restritas pelo alelo HLA que apresentam uma maior diversidade de peptídeos no timo.

Estes resultados são consistentes com estudos anteriores de desenvolvimento de repertório em camundongos e sugere que as células T restritas ao HLA-B57 podem reconhecer epítopos peptídicos virais com um maior número de mutações pontuais. O aparecimento destes epítopos mutantes pode ocorrer durante a infecção, gerando variantes resistentes à drogas ou ainda que aceleram a progressão da doença. A hipótese descrita no estudo é corroborada por dados experimentais que demonstram que células T CD8+ de pacientes HLA-B57+ eram mais reativas a diferentes epítopos mutantes do HIV do que as células dos pacientes que expressam HLA-B8 (que é associado com rápida progressão para a AIDS e liga-se uma maior diversidade de peptídeos self).

Apesar de serem benéficas no tratamento da infecção viral, as células T restritas pelo alelo HLA que se ligam a menos peptídeos (como HLA-B57 e HLA-B27) estão sujeitas a uma seleção negativa menos rigorosa no timo. Isto pode trazer desfechos desagradáveis, como o aumento de chance de ocorrência de doenças autoimunes.

Vale a pena dar uma conferida no trabalho.

Referência: Košmrlj, A. et al. Effects of thymic selection of the T-cell repertoire on HLA class I-associated control of HIV infection. Nature 5 May 2010 (doi: 10.1038/nature08997)