Agrupando MHCs em supertipos

    Evidentemente a atividade fisiológica do chamado "complexo principal de histocompatibilidade" (MHC, na sigla em inglês) não tem qualquer relação com "histocompatibilidade" em transplantes de órgãos e tecidos, uma situação "artificial", desenvolvida pela medicina moderna, que não ocorre na natureza. A atividade desta molécula está vinculada a resposta imunológica, sendo responsável pela apresentação de peptídeos na superfície celular (conforme discutido em diversos posts do SBlogI). Uma característica marcante desta molécula, sobretudo com relação ao chamado MHC de classe I (MHC-I), é a variabilidade polimórfica. A "região do MHC", no braço curto do cromossomo 6 humano (6p21.3), é a região mais polimórfica e com a maior densidade de genes em todo o genoma humano [1,2]. Atualmente são conhecidos mais de 9 mil alelos de MHC-I em humanos e mais de 3 mil alelos de MHC-II, segundo dados do hla.alleles.org. Toda esta variabilidade, somada ao papel desta molécula na resposta imunológica, acaba tendo consequências diretas sobre a rejeição aos transplantes [3], o que explica o contexto em que o MHC foi descoberto e a razão de ter recebido um nome que não identifica sua "real" função biológica.

   Identificar os alelos de MHC e a consequente compatibilidade entre doadores se tornou algo essencial para a imunologia clínica e rapidamente os diversos alelos de MHC começaram a ser agrupados em sorotipos, conforme seu reconhecimento em testes com anticorpos. Posteriormente esta identificação passou a ser substituída pelo sequenciamento dos genes de MHC e por métodos baseados em PCR [3], uma vez que a resolução dos métodos sorológicos não parecia ser suficiente. 

  A capacidade de "agrupar" alelos de MHC de acordo com suas similaridades também tem outra importante aplicação, o desenvolvimento de vacinas. Os diferentes alelos de MHC apresentam especificidade para um conjunto diferente de peptídeos, consequentemente cada indivíduo poderá responder de formas distintas a um dado alvo antigênico. Uma vez conhecidas as frequências dos alelos e os grupos predominantes, pode se tornar possível desenhar vacinas que tenham maior cobertura na população de interesse [4]. Em 1999, Alessandro Sette e John Sidney introduziram o conceito de "Supertipo" para os alelos de MHC-I [4]. Analisando os conjuntos de peptídeos apresentados pelos alelos de MHC conhecidos (utilizando dados experimentais), eles foram capazes de agrupar 80% dos 945 alelos avaliados em apenas nove supertipos: A1, A2, A3, A24, B7, B27, B44, B58 e B62 [4,5]. Embora a nomenclatura destes grupos, bem como a própria nomenclatura dos alelos de MHC, faça referência as formas de classificação anteriores, a análise baseada nos ligantes revela um padrão de agrupamento muito diferente. Os alelos HLA-A*68:01 e HLA-A*68:02, por exemplo, pertencem ao mesmo sorotipo (HLA-A68) e diferem entre si por apenas 5 polimorfismos [6]. Três destes polimorfismos se localizam no chamado "F pocket", uma das cavidades na fenda de ligação ao peptídeo. Estes polimorfismos, portanto, não são acessíveis aos anticorpos utilizados na classificação sorológica, o que explica seu agrupamento no mesmo sorotipo. Por outro lado, eles alteram dramaticamente a especificidade da fenda destes MHCs, de modo que a análise dos ligantes classifica os alelos HLA-A*68:01 e HLA-A*68:02 em dois supertipos distintos, A3 e A2, respectivamente [5,6]. 

 O trabalho pioneiro de Sette & Sidney abriu caminho para uma série de outras abordagens computacionais, tentando aprimorar esta classificação em supertipos. Apesar de suas diferenças, estes trabalhos podem ser divididos em pelo menos três abordagens principais: (i) baseadas nos ligantes [4,7,8,9], (ii) baseados nas proteínas (MHC) [10] e (iii) estratégias que combinam as informações de ambas as fontes [5,11,12,13]. Lembrando que as abordagens baseadas em proteína (ou combinadas) tentam agrupar os MHCs com base nos motifs dos pockets ou alguma propriedade estrutural, uma vez que a maior parte da sequência dos MHCs é conservada e seu alinhamento leva a agrupamentos incorretos [9]. Alguns novos supertipos foram propostos, bem como a possível divisão de alguns dos supertipos originais [6,9], mas de modo geral estes trabalhos concordam que a maioria dos alelos analisados podem ser classificados em um grupo reduzido de supertipos. Infelizmente o número de alelos analisados ainda é bem menor que o número de alelos conhecidos (volume reduzido de dados para a maioria dos alelos), mas o refinamento destes métodos poderá ter implicações em diversas áreas da imunologia, nos auxiliando a compreender (e quem sabe manipular) pelo menos uma parte da enorme variabilidade envolvida nas repostas imunológicas.

Figura 1. Classificação dos alelos de MHC-I humanos em supertipos, segundo publicação recente de Harjanto e colaboradores [13].

Referências:

1. Vandiedonck C and Knight JC. The human Major Histocompatibility Complex as a paradigm in genomics research. Brief Funct Genomic Proteomic. (2009a) 8:379-394.

2. Xie T, Rowen L, Aguado B, Ahearn ME, Madan A, Qin S, Campbell RD and Hood L. Analysis of the gene-dense major histocompatibility complex class III region and its comparison to mouse. (2003) Genome Res 13:2621-2636.

3. Tiercy JM. Molecular basis of HLA polymorphism: implications in clinical transplantation. Transpl Immunol. 2002 May;9(2-4):173-80.

4. Sette A, Sidney J. Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):201-12.

5. Sidney J, Peters B, Frahm N, Brander C, Sette A. HLA class I supertypes: a revised and updated classification. BMC Immunol. 2008 Jan 22;9:1. 

6. Niu L, Cheng H, Zhang S, Tan S, Zhang Y, Qi J, Liu J, Gao GF. Structural basis for the differential classification of HLA-A*6802 and HLA-A*6801 into the A2 and A3 supertypes. Mol Immunol. 2013 Oct;55(3-4):381-92.

7. Reche PA, Reinherz EL: Definition of MHC supertypes through clustering of MHC peptide binding repertoires. LNCS, ICARIS 2004, 3239:189-196.

8. Lund O, Nielsen M, Kesmir C, Petersen AG, Lundegaard C, Worning P, Sylvester-Hvid C, Lamberth K, Roder G, Justesen S, et al. Definition of supertypes for HLA molecules using clustering of specificity matrices. Immunogenetics 2004, 55:797-810.

9. Thomsen M, Lundegaard C, Buus S, Lund O, Nielsen M. MHCcluster, a method for functional clustering of MHC molecules. Immunogenetics. 2013 Sep;65(9):655-65. 

10. Doytchinova IA, Guan P, Flower DR: Identifiying human MHC supertypes using bioinformatic methods. J Immunol 2004, 172:4314-23.

11. Hertz T, Yanover C: Identifying HLA supertypes by learning distance functions. Bioinformatics 2007, 23:e148-55. 

12. Tong JC1, Tan TW, Ranganathan S. In silico grouping of peptide/HLA class I complexes using structural interaction characteristics. Bioinformatics. 2007 Jan 15;23(2):177-83.

13. Harjanto S, Ng LF, Tong JC. Clustering HLA class I superfamilies using structural interaction patterns. PLoS One. 2014 Jan 27;9(1):e86655. 

Post de Dinler Amaral Antunes

Complimentary Postdoctoral Research Associate at the Kavraki Lab.

Department of Computer Science - Rice University (Houston, TX). 

Papel do MHC de classe II na imunidade inata

Células T conseguem detectar a presença de patógenos intracelulares graças a apresentação de peptídeos derivados destes patógenos na superfície de células apresentadoras de antígenos; e.g. células dendríticas, linfócitos B, macrófagos. Esta apresentação conta com glicoproteínas especializadas, conhecidas como moléculas do complexo de histocompatibilidade principal (MHC), que conduzem peptídeos do interior à superfície celular. É então, neste contexto, que as células T reconhecem antígenos derivados de patógenos e assim dão início ao desenvolvimento da resposta imune adquirida. Apesar de imaginar que isto seja de conhecimento de todos nós leitores deste Blog, vamos continuar a relembrar algumas funções específicas do MHC de classe II. O MHC II tem função crucial no desenvolvimento e função do sistema imune, função esta intimamente ligada às células T CD4: o MHC II é essencial para a determinação do repertório de células T através das seleções conhecidas como positiva e negativa que ocorrem no timo, além da apresentação de antígenos para o reconhecimento e ativação de células T CD4 que levam ao desenvolvimento de mecanismos efetores contra patogênicos. O MHC II, quando ativado, também pode mediar adesão celular, produção de citocinas, expressão de moléculas co-estimulatórias, proliferação celular e apoptose. Todos estas funções já são bem conhecidas e importantes no controle do câncer, doenças infecciosas, ou auto-imunes.

Uma das maneiras que os patógenos desenvolveram para evadir a resposta imunológica é a capacidade de diminuir os níveis de expressão do MHC II na superfície de suas células hospedeiras, limitando assim a sua exposição e consequentemente seu reconhecimento pelas células T CD4. Já foi descrito que a deficiência de MHC II diminui a produção de TNF-alfa por monócitos e macrófagos, quando estes são estimulados com o agonista do receptor do tipo toll (TLR) 4. No entanto, até agora, o mecanismo relacionando o MHC II e os TLRs no desencadeamento da resposta imune inata ainda não tinha sido desvendado.

Em um artigo recém saído do forno, Xinggang Liu e colaboradores descreveram uma função dita não clássica para o MHC II. O estudo mostra que animais deficientes em MHC II são mais resistentes ao choque endotóxico, induzido por doses letais de LPS ou pela infecção por bactérias Gram-negativas. Estes camundongos produzem in vivo menores níveis de citocinas proinflamatórias, incluindo IFN do tipo I. Mas, como isto acontece?

Aparentemente, quando estão no interior das células, mais especificamente nos endossomos, as moléculas de MHC II interagem com a tirosina quinase Btk via moléculas de CD40 e tornam a ativação de Btk mais estável. Uma vez ativada, esta tirosina interage com as moléculas adaptadoras MyD88 e TRIF, promovendo completa ativação da via de sinalização dos TLRs. Sendo assim, moléculas de MHC II podem agir como adaptadoras promovendo uma eficiente ativação da resposta imune inata desencadeada pela dos TLRs e seus ligantes.

Em um comentário sobre o artigo, publicado no mesmo volume do JEM, Hassan e Mourad incorporam os novos achados aos já publicados na figura abaixo propondo a sinalização do MHC II.

Vale a pena se aprofundar um pouco mais na leitura:

- Piani A et al. Expression of MHC class II molecules contributes to lipopolysaccharide responsiveness. Eur J Immunol. 2000 Nov;30(11):3140-6.

- Liu X et al. Intracellular MHC class II molecules promote TLR-triggered innate immune responses by maintaining activation of the kinase Btk. Nat Immunol. 2011 May;12(5):416-24.

- Hassan & Mourad. An unexpected role for MHC class II. Nat Immunol. 2011 May;12(5):375-6.

Imunologia molecular In silico – Parte II

 A Imunoinformática Estrutural

Conforme apresentado na primeira parte deste post, em 2009 o NBLI teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates. O grupo recebeu um auxílio de U$ 100.000 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I), voltado à identificação de padrões estruturais nestes complexos. No ano seguinte, o NBLI publicou um trabalho descrevendo padrões estruturais apresentados pelos epitopos quando complexados à fenda do MHC (Antunes e cols., 2010), padrão este que não era dependente da sequência do epitopo e que era específico para cada alotipo1 de MHC (Figura 1).

Figura 1. Exemplo da sobreposição de epitopos cristalografados na fenda de MHCs murinos. As estruturas de cinco epitopos restritos a H2-D^b (1CE6, 1S7V, 1WBZ, 1ZHB e 3BUY) e cinco epitopos restritos a H2-K^b (1FO0, 1FZJ, 1LK2, 1RJY e 1S7R) foram sobrepostas. (A) Visão lateral salientando as diferenças conformacionais apresentadas por epitopos no contexto do H2-D^b (vermelho) e do H2-K^b (azul), especialmente entre as posições 5 e 7 (p5-7). (B) Visão superior. (C) Sobreposição de duas estruturas cristalográficas (1S7V e 1S7R) apresentando o mesmo epitopo (KAVYNLATM) no contexto destes dois alotipos distintos. Modificado de Antunes e cols., 2010.

   

      Este trabalho foi realizado a partir da análise de todas as estruturas de pMHCs até então determinadas experimentalmente para alguns dos alotipos de MHC de classe I mais estudados (H2-D^b, H2-K^b, HLA-A*02:01 e HLA-B*27:05), disponíveis no ProteinData Bank. Além do caráter descritivo, a identificação destes padrões permitiu o desenvolvimento de uma nova estratégia de predição de estruturas  de pMHC-I. Trabalhos recentes têm utilizado ferramentas de ancoramento molecular (docking) para a predição estrutural de complexos pMHC (Bordner, 2006; Antunes, 2010; Khan, 2010). O docking é amplamente utilizado para predizer o modo de ligação de fármacos e pequenos ligantes ao sítio ativo de enzimas e receptores proteicos, apresentando resultados rápidos e confiáveis (Morris, 2009; Trott, 2010). No entanto, sua acurácia decai rapidamente com o aumento do número de ligações flexíveis do ligante, o que aumenta o número de conformações possíveis e eleva o custo computacional para a resolução do problema (Chang e cols., 2010). Enquanto a maioria dos algoritmos disponíveis apresenta resultados confiáveis para o ancoramento molecular de ligantes com até 10 ligações flexíveis, um peptídeo típico (apresentado por MHC de classe I) possui cerca de 9 aminoácidos e pode apresentar mais de 40 ligações flexíveis. Neste contexto, a descoberta de padrões conformacionais específicos para cada alotipo de MHC viabiliza o docking de complexos pMHC-I, na medida em que permite reduzir o número de ligações flexíveis do ligante. Esta foi a premissa utilizada no desenvolvimento de uma nova estratégia de predição estrutural de complexos pMHC-I, referida como D1-EM-D2 (Figura 2).

Figura 2. Fluxograma da abordagem D1-EM-D2. A estrutura de um dado complexo pMHC-I, cuja estrutura ainda não é conhecida, pode ser modelada em três etapas: (i) Docking, (ii) Energy Minimization e (iii) Docking (D1-EM-D2). A sequência linear de aminoácidos de um peptídeo pode ser utilizada como entrada para um script do PyMOL (a), o qual gera um arquivo de coordenadas espaciais (PDB) para o epitopo alvo, ajustando a conformação da cadeia principal ao padrão “alotipo-específico”. Uma estrutura de referência contendo o alotipo de interesse é utilizada como “Doador de MHC”, removendo-se o peptídeo da fenda. O “Doador de MHC” e o “Epitopo 3D” são utilizados como entrada para o ancoramento molecular (docking) com o Autodock Vina (b), gerando um novo pMHC-I. Um ciclo de otimização da estrutura é realizado para ajustar o “Doador de MHC” ao novo epitopo. Modificado de Sinigaglia e cols., 2013.

Mesmo considerando-se apenas os genes clássicos de MHC em humanos (HLA-A, HLA-B e HLA-C)2, já são descritos mais de 8.000 alelos3, dos quais uma parcela insignificante possui estrutura conhecida. Cada um destes alelos codifica a cadeia pesada de um alotipo de MHC capaz de apresentar milhares de peptídeos, muitos dos quais seriam de grande interesse para estudos de imunologia (variantes virais, autoantígenos, epitopos que apresentam reatividade-cruzada, etc). Muitos avanços foram feitos no campo da Cristalografia de Raios-X e da Ressonância Magnética Nuclear, permitindo a determinação experimental de um número cada vez maior de estruturas proteicas. No entanto, estes métodos continuam sendo extremamente caros e demorados. Assim sendo, considerando-se a magnitude e a variabilidade deste sistema, análises estruturais em larga escala de complexos pMHC-I seriam praticamente inviáveis sem o auxílio de métodos in silico, rápidos, precisos e de baixo custo.

A abordagem D1-EM-D2 foi amplamente validada em comparação com estruturas cristalográficas, sendo então aplicada na predição em larga escala de complexos pMHC-I apresentando peptídeos imunogênicos. Estes complexos foram posteriormente disponibilizados em um banco de dados específico, o CrossTope (Sinigaglia, 2013). Juntamente com o arquivo contendo as coordenadas espaciais do complexo, o CrossTope disponibiliza informações sobre o alelo de MHC, a proteína e o organismo de origem do epitopo apresentado, etc. São fornecidos links para bancos com informações complementares, como o IEDB e o NCBI. Além disso, o banco fornece uma imagem do potencial eletrostático sobre a superfície do pMHC que fará contato com o TCR. Estudos recentes indicam que características estruturais desta superfície, como cargas e topografia, podem direcionar o reconhecimento pelos linfócitos T CD8+ (Sandalova, 2005; Antunes, 2011; Shen, 2013). De acordo com resultados in vitro, mesmo a troca de um único aminoácido pode abortar o reconhecimento por uma dada população de linfócitos (Fytili, 2008).

Figura 3. Potencial eletrostático na superfície de interação com o TCR. A imagem mostra a vista superior de três complexos pMHC formados por variantes de um mesmo epitopo (com trocas por alanina), no contexto do HLA-A*02:01. Observe a posição dos domínios α1  e α2 do MHC, entre os quais se localiza o epitopo. Regiões com cargas positivas (azuis) e negativas (vermelhas) são representadas em uma escala de -5 kT a +5 kT. As superfícies de complexos que estimulam altos níveis de IFN-gamma frente a uma população de linfócitos específica contra o tipo selvagem (CVNGVCWTV) são muito semelhantes (A e B), enquanto diferenças de topografia e cargas (setas verdes) são visíveis na superfície de um complexo que estimula fracamente a mesma população de linfócitos (C). Modificado de Antunes e cols., 2010.

Além de continuar trabalhando no aperfeiçoamento e automatização da abordagem para predição estrutural de complexos pMHC-I, nosso grupo tem especial interesse na predição de reatividade-cruzada entre epitopos virais. Na terceira e última parte deste post, serão apresentados resultados referentes ao uso de estatísticas multivariadas para a triagem virtual de complexos pMHC-I. Esta abordagem baseada em estrutura nos permitiu predizer uma reatividade-cruzada até então desconhecida, entre epitopos que não compartilhavam nenhum aminoácido em sua sequência, um resultado que já está sendo confirmado por experimentos in vitro.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

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1 A expressão “alelos de MHC” é usualmente utilizada para referenciar tanto as variantes dos genes quanto as diferentes proteínas codificadas por estas variantes gênicas. No entanto, este segundo uso da expressão não é adequado uma vez que o termo “alelo” se refere especificamente a DNA, não a proteína. A expressão “alotipo” é indicada para referenciar as diferentes proteínas codificadas por alelos de MHC.

2 A cadeia pesada do complexo responsável pela apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular é referida genericamente como MHC de classe I (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), mas a nomenclatura varia de acordo com a espécie. Por exemplo, em humanos ele recebe o nome HLA (na sigla em inglês para Human Leukocyte Antigen), em camundongos é referido como antígeno H2, etc.

3 Até as 14 horas de Quarta-Feira, dia 07/05/2014, havia 8.124 alelos de MHC de classe I listados no http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html.

Journal Club - IBA: Apresentação antigênica via Cross-dressing

A apresentação de antígeno via cross-dressing já foi tema de um post neste blog em abril passado. Voltamos hoje a abordar este tema pois o artigo publicado na Nature de março deste ano foi tema do Journal Club do nosso departamento esta semana.

Como já mencionado no post de abril, o cross-dressing é um terceiro mecanismo de apresentação de antígeno, no qual a APC adquire o complexo MHC:peptídeo expresso em uma célula infectada, via transferência desse complexo entre as membranas celulares, e então passa a ativar linfócitos T. O que difere a apresentação de antígeno via cross-dressing da apresentação cruzada (cross-presentation) é o fato que a primeira não necessita de qualquer processamento do complexo adquirido para sua exibição na membrana da APC, enquanto que na apresentação cruzada a APC captura componentes celulares da célula infectada, processa intracelularmente esses componentes para gerar peptídeos e os apresenta posteriormente via MHC de classe I em sua membrana, ou seja, a APC acopla os peptídeos na molécula de MHC que ela própria sintetizou.

Em 2008 Smyth, L. A. e colaboradores publicaram um trabalho que teve como objetivo testar se a transferência de complexos MHC classe I:peptídeo entre células é importante na estimulação de respostas por células T CD8+ e comparar este mecanismo com a via de apresentação-cruzada.

Foi observado que Células Dendríticas diferenciadas da medula óssea (BMDCs) e maturadas por Poli I:C (um agonista de TLR3), foram capazes de adquirir complexos MHC:peptídeo provenientes de BMDCs alogenêicas previamente pulsadas com um peptídeo de OVA257–264, OVA solúvel ou infectadas com um adenovírus recombinante expressando OVA. Estes complexos MHC:peptídeo adquiridos foram reconhecidos por células T CD8+ específicas, as quais proliferaram e produziram IL-2 em resposta a esta interação. Comparando a eficiência da apresentação de antígenos via transferência de complexos MHC:peptídeo e apresentação-cruzada, foi possível verificar que Células Dendríticas (DC) esplênicas CD8+, tem maior eficiência na estimulação de células T quando adquirem o antígeno via apresentação cruzada. Quando foram analisadas as eficiências de apresentação de antígeno de BMDCs e DCs esplênicas CD8-, foram observados resultados contrastantes, em que estes dois tipos de DCs foram mais eficientes na estimulação de células T CD8+ quando adquiriram os complexos MHC:peptídeo pré-formados. A partir destas observações, foi concluído que a eficiência relativa da transferência de MHC e apresentação-cruzada difere significativamente entre diferentes subtipos de DCs.

Na Letter, publicada na Nature, Walkim e Bevan, demonstraram a importância do fenômeno de cross-dressing in vivo na ativação de células CD8+ de memória. Recorrendo primeiramente a experimentos in vitro, os autores pulsaram com peptídeo BMDC de camundongos (doadoras) e as co-cultivaram com outras BMDCs que não haviam tido contato anterior com o peptídeo (receptoras). Após a separação dessas duas populações de DCs o grupo verificou que apesar de só uma população de BMDCs ter sido pulsada com o peptídeo, ambas foram capazes de induzir a proliferação de células T CD8+. Ao utilizarem como receptoras DCs derivadas de MO de animais Tap1 KO, a capacidade de induzir a proliferação de células T CD8+ após o co-cultivo com as DCs doadoras permaneceu inalterada, comprovando que nesse caso a indução da proliferação de linfócitos não acontecia via mecanismos de processamento e apresentação de antígenos convencionais.

Após a confirmação in vitro da ocorrência do cross-dressing entre DCs, os autores recorreram a modelos experimentais onde animais F1 (H-2b / H-2d) letalmente irradiados receberam transplantes de MO derivadas de animais B6 GFP+ (H-2d) e posteriormente foram submetidos à infecção com o vírus da LCMV. Dias após a infecção, células CD11c GFP+ foram isoladas do baço dos animais F1 e colocadas em cultivo com hibridomas de células T específicos para H-2b. Mesmo portando MHC diferente do hibridoma, a ativação da célula T CD8+ ocorreu, sugerindo que as CD11c GFP+ adquiriram complexos peptídeo-MHC pré-formados provenientes de DCs específicas para H-2Ld do parênquima dos animais F1.

Em um experimento elegante o grupo transferiu MO de animais Balb/c CD11cDTR nos camundongos F1 e em seguida transferiu adotivamente tanto linfócitos naive (CD45.1) quanto de memória (GFP+). Em um momento seguinte as DCs CD11cDTR foram depletadas com toxina diftérica e os animais F1 foram infectados com o vírus da estomatite vesicular truncado com OVA. Sete dias após a infecção, os linfócitos CD45.1 e GFP+ foram recuperados do baço dos animais F1 e o grupo pôde observar que somente as células de memória haviam expandido. Entre outras coisas, o grupo sugere que o cross-dressing é especialmente importante para a expansão de células T CD8+ de memória devido à baixa necessidade de antígeno que as mesmas apresentam para serem ativadas.

Com este trabalho, a apresentação de peptídeos virais via cross-dressing de células dendríticas parece ter um papel biológico durante uma re-infecção viral, promovendo um boost na ativação de células T CD8+ de memória.

Post de Luis Gustavo Gardinassi, Gabriela Scortegagna e Carolina Oliveira.

Clássicos e não-clássicos e o MHC classe II

Olá pessoal,

Vou aproveitar a ocasião de que uma parte do povo aqui do lab publicou um trabalho recentemente no PNAS (Yoon et al, 2012) e falar um pouco sobre um aspecto de apresentação de antígenos de classe II que acho que não foi ainda abordado aqui no SBI Blog (desculpem se já foi!) - as moléculas não-clássicas de HLA, HLA-DM e HLA-DO.

Nas células apresentadoras de antígeno (APC, da abreviatura em inglês), as moléculas de MHC classe II são carregadas com peptídeos sob o controle da cadeia invariante (Ii), que bloqueia os sítios de ligação do antígenos no MHC de classe II em compartimentos pré-endossomais, desta maneira assegurando que o MHC de classe II receberá o antígeno no momento certo. Nos endossomas, várias moléculas cooperam para que o peptídeo seja carregado corretamente: proteases que degradam Ii, e a molécula HLA-DM e o seu regulador, o HLA-DO.

Em detalhes (ver também a Figura, com agradecimentos à Cornelia Rinderknecht), durante as etapas iniciais da maturação do MHC de classe II, a forma não processada do Ii (na forma de complex triplo) liga-se ao nicho de ligação de peptídeo, servindo de ‘peptídeo-substituto’. Uma porção da cauda citoplasmática do Ii guia este complexo MHC de classe II/Ii aos endossomas, onde o Ii é processado por catepsinas, resultando no ‘peptídeo associado à classe II’, ou CLIP, em inglês. O HLA-DM então é quem faz a dissociação do CLIP, catalizando a troca do CLIP pelos peptídeos apropriados (cineticamente estáveis), atuando como um “editor” de peptídeos,  provavelmente promovendo a troca de peptídeos até que um estável seja encontrado.

Por sua vez, o HLA-DM está ligado fortemente ao HLA-DO. O HLA-DO é um inibidor do HLA-DM e modula a função do HLA-DM. Análises cinéticas (trabalho em colaboração do nosso lab) da estrutura cristalizada do complexo HLA-DM/HLA-DO mostrou que o HLA-DO é um inibidor competitivo do HLA-DM (Stern et al, 2012, resumo na AAI).  Esta inibição é dependente do pH, assim, nos endossomas, o HLA-DM e o HLA-DO separam-se e o HLA-DM consegue atuar sobre o MHC de classe II.

Inicialmente se acreditava que o HLA-DO estava presente somente em linfócitos B, e assim, que talvez não fosse tão importante na apresentação de antígenos em geral. Mas em 2006 o nosso grupo publicou que alguns tipos de células dendríticas humanas expressam HLA-DO, mas não monócitos ou células dendríticas derivadas de monócitos in vitro (Hornell et al, 2006). Assim, HLA-DM e HLA-DO são provavelmente fatores críticos na determinação do repertório de peptídeos self e não-self, e consequentemente, participam da resposta imune.

O trabalho recente aqui do lab identificou uma região do HLA-DM importante para a interação com HLA-DO, o que sugere uma região putativa de ligação e também a orientação da ligação entre HLA-DM e HLA-DO. Este é um trabalho difícil dada a instabilidade do HLA-DO solúvel. O trabalho com a estrutura cristalizada também revelou que o HLA-DO liga-se ao HLA-DM na mesma região que o MHC de classe II liga-se ao HLA-DM. Uma grande parte do lab aqui se concentra agora em entender em maiores detalhes a interação física entre HLA-DM, HLA-DO e HLA-DR, e o que esta interação pode revelar sobre como esta moléculas interagem e quem sabe, sobre os mecanismos envolvidos na associação de MHC de classe II e doenças auto-imunes.

Biblio:

Yoon T, Macmillan H, Mortimer SE, Jiang W, Rinderknecht CH, Stern LJ, Mellins ED.

Proc Natl Acad Sci U S A. 2012 Jul 10;109(28):11276-81. Epub 2012 Jun 25.

Mapping the HLA-DO/HLA-DM complex by FRET and mutagenesis.

Hornell TM, Burster T, Jahnsen FL, Pashine A, Ochoa MT, Harding JJ, Macaubas C, Lee AW, Modlin RL, Mellins ED.

Human dendritic cell expression of HLA-DO is subset specific and regulated by maturation.

J Immunol. 2006 Mar 15;176(6):3536-47.

Lawrence Stern,Abigail Guce, Sarah Mortimer,Taejin Yoon,Corrie Painter,Wei Jiang, and Elizabeth Mellins.  J Immunol May 2012 188 (Meeting Abstract Supplement) 106.28

Predição da estabilidade dos complexos peptídeo:MHC e o "desprendimento" do ligante

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA

Figura 1. Ilustração de Eric Reits para representar a rota 
de apresentação de peptídeos endógenos. Uma amostra 
das proteínas intracelulares é processada e apresentada
na superfície celular no contexto do MHC-I, permitindo seu
 reconhecimento pelos linfócitos T (Yewdell et al., 2003).

    A apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular representa uma rota central para a resposta imunológica adaptativa. Este mecanismo, presente em praticamente todas as células nucleadas do organismo, possibilita que linfócitos T circulantes (CD8+) "fiscalizem" o conteúdo intracelular destas células apresentadoras, permitindo a detecção de infecções virais e tumores. Esta rota pode ser explicada de maneira simples, sendo visivelmente uma espécie de "controle de qualidade" do conteúdo intracelular (Figura 1). Os detalhes moleculares desta rota, no entanto, são bastante complexos e variáveis. Por exemplo, se tentarmos entender quais são os requisitos responsáveis pela capacidade de um peptídeo de desencadear a ativação de um linfócito, perceberemos o envolvimento de múltiplas variáveis relacionadas a diferentes etapas deste processo. Em primeiro lugar, o peptídeo precisa ser capaz de "sobreviver" ao processamento, uma vez que nem todos os possíveis peptídeos contidos em uma dada proteína são apresentados na superfície (Yewdell et al., 2003). Um ponto importante nesta etapa de processamento diz respeito a capacidade de ligação dos peptídeos gerados às moléculas de MHC de classe I (sigla em inglês para Complexo Principal de Histocompatibilidade). Hoje temos acesso a uma ampla coleção de dados sobre ligação de peptídeos a moléculas de MHC e é possível inclusive predizer a afinidade de ligação do complexo considerando-se as sequências das moléculas envolvidas (Backert & Kohlbacher, 2015; Karosiene et al., 2012). No final desta rota, o conjunto peptídeo:MHC (pMHC) poderá interagir com linfócitos circulantes e o desfecho da resposta dependerá de uma série de fatores envolvidos na afinidade da interação entre o pMHC e o receptor de linfócito T (ou TCR, na sigla em inglês). Em um capítulo de livro publicado em 2012 nós utilizamos o termo reatividade para nos referirmos a esta etapa final e os fatores envolvidos na ativação dos linfócitos T citotóxicos. No mesmo capítulo, nós discutimos a importância de um "nível de seleção" intermediário entre o processamento e a reatividade, relativo a estabilidade do complexo pMHC.
    Embora intuitivamente possamos imaginar que a estabilidade de um dado pMHC será um reflexo da afinidade de ligação do complexo, de modo que apenas pMHCs estáveis serão formados no retículo endoplasmático e consequentemente apresentados na superfície, esta relação nem sempre é observada. Na verdade, os dados sugerem que a estabilidade do pMHC é inclusive um melhor preditor da imunogenicidade do peptídeo do que a própria afinidade de ligação (van der Burg at al., 1996; Harndahl et al., 2012; Jorgensen et al. 2014). Embora os já conhecidos "resíduos âncoras" sejam primariamente envolvidos na afinidade do complexo, as cadeias laterais de outros resíduos secundários podem influenciar positivamente ou negativamente na manutenção do modo de ligação mais favorável, o que pode levar a instabilidade do complexo (Jorgensen et al. 2014). Isso acaba tendo impacto direto na possível estimulação de linfócitos, sobretudo considerando que uma diversidade de peptídeos está sendo apresentada ao mesmo tempo e que estes diferentes complexos pMHC estão competindo pela interação com o TCR; complexos mais numerosos e mais estáveis tem maior chance de serem reconhecidos (dependendo também dos fatores envolvidos na reatividade).

Figura 2. Visualização dos dados obtidos de uma dinâmica
 molecular de um complexo pMHC não estável. Os cones
verdes indicam a direção e a intensidade das forças
observadas em determinados resíduos. Neste exemplo,
elas indicam uma forte tendência de desprendimento
da porção C-terminal do ligante. Estes dados diferem
daqueles observados para um ligante controle. Modificado
 da Tese de Doutorado de Maurício M. Rigo (2015). 

    O servidor netMHCstab utiliza redes neurais para predizer a estabilidade de um dado complexo pMHC com base na análise de sequencias, tendo apresentado resultados promissores na identificação de epitopos de linfócito T quando combinado a um método consenso para predição de afinidade de ligação ao MHC (Jorgensen et al. 2014). No entanto, estes métodos baseados em análise de sequência são muito dependentes da qualidade e do volume de dados utilizado para treinar as predições (Wang et al., 2014). Esta restrição muitas vezes impede a generalização das predições para outros alelos de MHC ou outros tamanhos de ligantes, visto que os dados experimentais ainda são limitados para a maioria dos alelos (considerando-se apenas os MHCs de classe I clássicos, são mais de 10 mil alelos descritos em humanos). Métodos estruturais tem potencial para permitirem uma maior generalização das predições, especialmente considerando-se uma característica dinâmica como estabilidade. Em tese, tendo-se uma estrutura inicial do complexo é possível calcular as forças envolvidas na interação e simular o comportamento do complexo em solução. Durante seu trabalho de Doutorado desenvolvido na UFRGS, meu colega Maurício Menegatti Rigo utilizou métodos de docking e dinâmica molecular para estudar a estabilidade de ligantes na fenda do MHC. Utilizando dados obtidos de simulações considerando a real estrutura das moléculas envolvidas (full-atom MD) foi possível observar claros sinais de instabilidade em peptídeos mutados (Figura 2), além de identificar algumas interações que parecem ser mais importantes para a manutenção do modo de ligação.
    A dinâmica molecular é a ferramenta de bioinformática estrutural com a maior precisão em termos da correta descrição das forças envolvidas e das trajetórias moleculares preditas para um dado sistema. No entanto, esta precisão acarreta um elevado custo computacional que em muitos casos inviabiliza a análise de sistemas muito grandes, ou a observação de eventos que ocorrem em escalas de tempo superiores a centenas de microssegundos. O trabalho descrito acima corrobora o potencial preditivo da dinâmica molecular quanto a instabilidade do complexo, mas nestas simulações curtas (20 ns) não é possível observar o completo "desprendimento" do ligante. Na verdade, um trabalho recente demonstrou que o desprendimento completo pode não ser observado mesmo em uma dinâmica molecular de 1000 ns (1 µs), a mais longa simulação de um complexo pMHC já publicada (full-atom MD) (Knapp et al., 2015). Para conseguir observar este evento em nível molecular, os autores implementaram uma estratégia alternativa. Em primeiro lugar, ao invés de considerar a descrição atômica das moléculas envolvidas, eles utilizaram uma representação simplificada dos resíduos (coarse-grained 3-point model). Em segundo lugar, eles utilizaram um método de segmentação hierárquica da proteína para restringir a flexibilidade de grupos de resíduos, o que também melhora a performance (reduz graus de liberdade) e previne a perda do correto enovelamento da proteína (unfolding). Os movimentos neste sistema foram então explorados através do método de Monte Carlo. Finalmente, eles realizaram repetidas etapas de simulated annealing para permitir uma rápida exploração do espaço conformacional sem ficar restrito a mínimos locais de energia. Esta abordagem permitiu observar o completo desprendimento da fenda em um tempo computacionalmente viável (Figura 3) e foi capaz de discriminar entre ligantes e não ligantes (AROC = 0,85). Esta é a primeira vez em que são descritas conformações intermediárias do ligante durante o processo de desprendimento do MHC, possibilitando novos insights e revelando outros detalhes moleculares importantes para o desencadeamento de uma resposta imunológica celular. A capacidade de predizer dados experimentais corrobora a hipótese de que as simplificações realizadas não prejudicaram a correta descrição das moléculas simuladas, mas futuros experimentos serão necessários para determinar a real acurácia e a potencial generalização dos resultados observados.

Figura 3. Simulação do processo de desprendimento de um peptídeo da fenda do MHC utilizando (A) uma nova metodologia baseada em coarse-grained Monte Carlo e simulated annealing (HNMMC) ou (B) dinâmica molecular. O peptídeo utilizado (AAAKTPVIV) foi previamente descrito como não ligante de HLA-A*0201, alelo utilizado nestes experimentos. A técnica HNMMC foi capaz de descrever um completo desprendimento da fenda, em um tempo muito inferior ao da dinâmica molecular (C). Figura publicada em Knapp et al., 2015.

O Sabre de Luz do Jedi

Quando eu era estudante no National Jewish, uma das minhas aulas favoritas era a do John Kappler. Quimico de formação, ele apresentava de forma tão fascinante as interações moleculares, e em especial sua favorita, a do TCR com o MHC, que estrutura parecia fácil. Ainda hoje, quando estrutura me parece uma coisa espinhosa, tento lembrar daquelas aulas, onde aprendi o quanto a estrutura pode nos dizer sobre a função.

Na última Immunity, o casal Kappler-Marrack mostra que um mesmo TCR pode reconhecer moleculas de MHC classe I e MHC classe II, cada uma com um ligante peptídico diferente. Para isso, existe uma flexibilidade da molecula, que se adapta ao ligante diferente, mesmo tendo sido selecionada no timo para ser restrita a uma determinada molecula de MHC. Basicamente, parece que os dominios de um mesmo TCR que interagem com os aminoacidos conservados do MHC – e que se acredita terem evoluido para interagir com o MHC – permanecem na mesma orientação quando ligados em MHC classe I ou II. Contudo, a molécula pode rearranjar os domínios que interagem com o antigeno (!). A região J do dominio variavel gira o CDR1 e o CDR2 pra fora, afastando eles dos CDRs da outra cadeia. O TCR fica mais abertinho, e podem ocorrer tanto no V alfa como no V beta domain. Os residuos da pontinha dos CDRs se mexem.

Mesmo quem não curte estrutura, é legal dar uma passeada pelo artigo. Reatividade cruzada é um conceito que todo mundo usa, mas aqui estão mostrando como ela acontece na prática. E enquanto a reatividade cruzada pode ser vantajosa numa resposta immune, tambem sabemos que pode dar zebra. Nas minhas aulas, os alunos aprendem que se o linfócito T é o cavaleiro Jedi, o TCR é o seu sabre de luz, algo que ele só obtém após um árduo processo de educação e seleção. E um instrumento poderoso que confere a grande maioria das suas espantosas habilidades. O trabalho do grupo de Kappler nos mostra que o sabre de luz é mais versátil do que imaginávamos. Futuros estudos podem nos ajudar a entender se isso constitui um dos mecanismos pelos quais ele passa para o lado negro da força.

Immunity. 2011 Jul 22;35(1):23-33. Epub 2011 Jun 16. A Single T Cell Receptor Bound to Major Histocompatibility Complex Class I and Class II Glycoproteins Reveals Switchable TCR Conformers. Yin, L., Huseby E, Scott-Browne J, Rubtsova K, Pinilla C, Crawford F, Marrack P, Dai S, Kappler JW.

Sistemas Imunes I: O MHC dos Baskervilles

"So, the naturalists observe, the flea,

Hath smaller fleas that on him prey;

And these have smaller still to bite 'em;

And so proceed, ad infinitum”

Jonathan Swift

Com o post de hoje vamos inaugurar no blog da SBI uma coluna mensal dedicada a examinar a imunologia a luz da evolução. Não tem erro no título, vamos mesmo falar de sistemas imunes, no plural. Passearemos pelas diversas células e estruturas que participam de respostas imunes nos 34 (dependendo de quem está contando) filos do reino animal, e mais o ocasional fait divers do mundo das plantas, protozoários e outras criaturas esquisitas. Alguns destes componentes serão homólogos dos nossos velhos conhecidos do sistema imune dos vertebrados com mandíbula, outros serão análogos facilmente reconhecíveis, soluções convergentes para problemas comuns, e ocasionalmente veremos ainda moléculas e mecanismos completamente únicos.

Para começar, vamos ficar no nosso pequeno raminho da árvore da vida, o sub-filo Vertebrata, filo Chordata, ali no graveto dos peixes ósseos. Mais especificamente começaremos com Gadus morhua, também conhecido (e consumido) como bacalhau.

Kjetill Jakobsen, da Universidade de Oslo, e vários colegas (como o paper é de genômica, põe et al nisso) decidiram sequenciar o genoma do bacalhau com objetivos principalmente comerciais. Até ai, tudo bem, a Noruega vive em grande parte da pesca do Gadus morhua, e enfrenta vários desafios importantes, desde o declínio acentuado dos estoques naturais (sim, este declínio tem muito a ver com o fato da Noruega e outros dependerem da pesca do bacalhau, mas adiante…), até uma difícil transição para a piscicultura. Estes dois pontos já obrigariam a equipe a prestar uma atenção especial às sequências ligadas ao sistema imune do bicho no seu genoma. Mas a esta altura, genomas sequenciados já não são novidade. Por que então encontramos Kjetill e seus colegas nas páginas da Nature*, com destaque em várias outras revistas, depois de passar meros 830 milhões de pares de base pela plataforma 454 da Roche?

O genoma do bacalhau revelou muitas das idiossincrasias esperadas de sistemas biológicos, adaptações interessantes as suas condições peculiares de vida. Lá esta por exemplo, uma modificação curiosa da hemoglobina, talvez uma solução para problemas decorrentes das baixas temperaturas que enfrenta este peixe. Mas a grande surpresa veio por conta do que não estava lá.

Nosso amigo da mesa Natalina (era a especialidade da minha avó) vive muito bem obrigado tendo perdido todos os genes do MHC classe II, bem como a cadeia invariante. Provavelmente como consequência disto, o gene CD4 também não é funcional no bacalhau, embora neste caso pelo menos encontramos o seu fóssil, na forma de um pseudogene truncado. Ou seja, o bacalhau perdeu completamente a resposta T helper tradicional- o que explica uma observação que intriga a (pequena, e muito escandinava) comunidade dos imunobacalhólogos desde pelo menos 2005: o bacalhau faz uma resposta clássica de anticorpos muito fraca a seguir a imunização. Não sabemos ainda como funciona o sistema imune do bacalhau, mas estão no genoma muitas pistas interessantes: genes da família toll extremamente diversificados, expansões de algumas famílias de citocinas, e uma muito intrigante diversificação dos genes do MHC classe I. Os autores falam em 100 locos (não alelos, isso seria banal para o MHC, locos) identificados de MHC I, o que os leva a propor uma hipertrofiada via de cross-presentation como possível alternativa. O que os autores não discutem é que pela teoria clássica de evolução da diversidade do MHC (que prevê muitos alelos e poucos, muito poucos, locos), este arranjo levaria normalmente à deleção de quase todos os linfócitos CD8 durante o desenvolvimento no timo. Perceber a seleção de células T no timo do bacalhau de repente tornou-se um problema fascinante.

Vale aqui adicionar alguns detalhes sobre o bacalhau. No mar ele atinge até 2 metros de comprimento e pode pesar 96 quilos ou mais. A maturidade sexual chega entre os 2 e 4 anos de idade, e ele vive 13 anos ou mais. Se adicionamos a isto uma dieta omnívora, e muitos (e muito diversos) parasitas (Perdiguero-Alonso et al, Parasites & Vectors, 2008, 1:23), temos a receita para um vertebrado com bons incentivos para ter uma imunidade eficiente. Além da resposta de anticorpos fraca que mencionamos acima, o bacalhau também apresenta um elevado número de neutrófilos em circulação, e uma alta concentração de IgM no soro.

Um modesto projeto ligado a piscicultura nos trouxe então a um ponto muito interessante, que remete a uma das motivações iniciais do estudo da evolução do sistema imune: a de que alargando o número de espécies sobre as quais conhecíamos algo a respeito do sistema imune, cedo ou tarde conseguiríamos deduzir a sequência evolutiva mais lógica para o surgimento do sistema imune dos vertebrados. As hipóteses foram se sucedendo ao longo dos anos 70 e 80. A immunoglobulina seria mais próxima da molécula primitiva, por se ligar diretamente aos antígenos. Não, seria o receptor de célula T, por ter apenas uma forma, presa a membrana. O proto-linfócito e seu receptor seriam parecidos com as células gama delta modernas (este argumento ia frequentemente buscar apoio em Haeckel). Enfim, eram hipóteses a gosto do freguês.

E ai veio a descoberta do Big Bang: era tudo ou nada. Na evolução do sistema imune dos vertebrados, apareciam juntos, nos peixes cartilaginosos, todos os seus principais componentes. Lá estavam, no tubarão, perfeitamente reconhecíveis, as imunoglobulinas, os receptores T (alfa beta e gama delta), CD4, CD8, MHC I e II. A sequência que nos interessava no melhor dos casos sumiu com a extinção dos placodermes, os assustadores peixes com armadura que dominavam os mares do Siluriano. Agora, pela via da perda de um ramo crucial do sistema imune, podemos investigar como se vive sem um componente fundamental da nossa imunidade.

Thiago Carvalho

*Star et al, “The genome sequence of Atlantic cod reveals a unique immune system”, Nature 2011, AOP.

Entrevistas ImunoFoz 2011 - Koichi Kobayachi

SBlogI entrevista:

Dr. Koichi S. Kobayashi
Harvard Medical School, EUA

Palestrante da mesa-redonda 'Innate Immune Receptors in Pathogen Recognition and Inflammation' (16/10/2011)

SBlogI - What is the theme of your lecture at ImunoFoz 2011?

Kobayashi, K.S. - I will talk about the regulation of MHC molecules by the NLR family, consisting of cytoplasmic proteins involved in the recognition of microbes.

SBlogI - What is the main finding or conclusion that will be emphasized?
Kobayashi, K.S. - CIITA, another NLR protein, has been known as an MHC class II transactivator. We have identified NLRC5 as the transactivator of MHC class I.      

 

SBlogI - What is the significance of this finding? 

Kobayashi, K.S. - The search for transactivator of MHC class I genes has been ongoing for the past 18 years, but had not been fruitful until our discovery.

 

SBlogI - What are the future perspectives in this area?

Kobayashi, K.S. - Molecular mechanisms underlying how NLRC5 transactivates MHC class I genes should be clarified.

 

SBlogI - What are the challenges in this area? Are there controversies? Opponent hypotheses?
Kobayashi, K.S. - NLRC5 was proposed to be an inhibitor of TLR and RLR signaling by interacting with IKK and RIG-I. Our and other groups’ data did not support it. 

 

SBlogI - Any suggestions for background reading?

Kobayashi, K.S. - Meissner TB, et al. NLR family member NLRC5 is a transcriptional regulator of MHC class I genes. PNAS. (2010) 107 (31): 13794-9.