Na rota para uma ferramenta de predição de reatividade cruzada

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Em posts anteriores eu apresentei trabalhos desenvolvidos pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI/UFRGS), com foco na análise estrutural de complexos peptídeo:MHC (pMHC) e na predição de reatividade cruzada de linfócitos T (imunologia in silico, imunidade heteróloga). O grupo continua desenvolvendo esta linha de pesquisa, aprimorando uma metodologia para agrupar alvos virais com base na similaridade estrutural no contexto do MHC. Complexos pMHC estruturalmente semelhantes, apresentam maior probabilidade de ativar uma mesma população de linfócitos e, por outro lado, esta probabilidade é muito baixa para complexos muito diferentes. 

Em sua publicação mais recente (Mendes et. al, 2015), o grupo descreve uma versão aprimorada desta metodologia. Inicialmente, a estrutura dos alvos de interesse é predita, no contexto do MHC, utilizando uma metodologia baseada em ancoramento molecular (docking). Avaliando cristais de complexos TCRpMHC, o grupo identificou uma série de resíduos frequentemente envolvidos no reconhecimento dos alvos de linfócitos T, informação que foi utilizada para guiar a análise dos complexos modelados. Estes resíduos conservados, ou "regiões de interesse", foram utilizados para extrair dados estruturais, como área de acessibilidade ao solvente e potencial eletrostático na superfície molecular. Uma vez extraídos, estes dados foram utilizados em uma análise de agrupamento hierárquico (HCA, do inglês Hierarchical Cluster Analysis), revelando os complexos mais semelhantes. Outra inovação neste trabalho, diz respeito ao uso do pacote pvclust (linguagem R) para a geração do HCA. Além de realizar o agrupamento, este pacote fornece duas medidas de confiabilidade (bootstrap) para cada nó da árvore, permitindo a fácil identificação dos agrupamentos mais confiáveis. 

Neste estudo piloto, foram avaliados um conjunto de alvos do vírus da Dengue e um grupo de epitopos de HCV.  Este conjunto de HCV já havia sido abordado em trabalhos anteriores, permitindo a comparação direta com a nova metodologia. O resultados são coerentes com dados experimentais e oferecem uma forma inovadora de prospectar candidatos a reatividade cruzada (Figura 1), com implicações diretas para o desenvolvimento de vacinas. 

A etapa de modelagem dos complexos demanda maiores recursos computacionais e é realizada utilizando um protocolo próprio, mas o grupo está nas etapas finais de desenvolvimento de uma ferramenta automatizada e gratuita. O desafio seguinte diz respeito a aplicação desta técnica em larga escala, para modelagem e análise de redes de reatividade cruzada previamente descritas em trabalhos experimentais. Estes resultados serão utilizados para refinar a técnica de agrupamento baseado em estrutura e permitir o futuro desenvolvimento de uma ferramenta de predição de reatividade cruzada.

Figura 1. Agrupamento hierárquico de alvos virais no contexto do MHC humano HLA-A*02:01. Este conjunto inclui 8 alvos de Dengue e 28 alvos de HCV. No caso da Dengue, reatividade cruzada foi confirmada entre alvos da proteína NS4b. No caso do HCV, reatividade cruzada foi observada entre o tipo selvagem (G1.01) e variantes dos genótipos 4, 5 e 6 (ex.: G4.21, G5.22 e G6.28). De acordo com dados experimentais, o genótipo 1 incluía alguns indivíduos que não apresentavam reatividade cruzada com o tipo selvagem (ex.: G1.04). Modificado de Mendes et. al, 2015.

Texto da IUIS sobre o Ebola

O Comitê de Imunologia Clínica da IUIS produziu um texto produziu o texto "A dead-end host: is there a way out? A position piece on the Ebola virus outbreak by the International Union of Immunology Societies” publicado no Frontiers of Immunology (27 October 2014 | doi: 10.3389/fimmu.2014.00562), que pode ser visualizado aqui.

Vejam alguns trechos:

"The fact that not everyone with Ebola virus disease (EVD) has died during the ongoing outbreak in West Africa, with an estimated case fatality rate of 70.8% by September 2014 (1), suggests that some kind of immunity to this virus is possible. "

“It is also likely that the increase in pro-inflammatory cytokines, shown experimentally and in plasma samples from patients with Ebola infection (5), contribute to enhancing vasodilation and the resulting cytokine storm (8) causes immune dysfunction and general “shut-down” of all immunity. Additionally, monkey models have shown that Ebola infection causes apoptosis in by-stander CD4 and CD8 lymphocytes and NK cells"

"As with all pathogens, Ebola has evolved to evade innate immunity by hijacking specific anti-viral pathways, resulting in immunosuppression. VP35 and VP24 inhibit type I interferon activity. VP35 inhi“its induction of IFN-beta production by suppressing phosphorylation and dimerization of IFN regulatory factor 3 (IRF-3) and enhancing SUMOylation of IRF-7 (5, 10). Viral P24 inhibits type I and type II IFN signaling by inhibiting nuclear signaling transducer ad activator of transcription 1 (STAT 1)”

Figura (aqui)

Imunologia molecular In silico – Parte III

 Clusterização Hierárquica e Reatividade Cruzada

A reatividade cruzada de Linfócitos T Citotóxicos (CTLs) é um fenômeno no qual uma mesma população de células CD8+ é capaz de reconhecer e responder contra dois ou mais alvos distintos (um mesmo TCR interage fortemente com mais de um complexo peptídeo:MHC). Esta característica dos CTLs tem aplicações diretas no desenvolvimento de vacinas e em outras áreas da imunologia. Conforme revisado na primeira parte deste post, houve algumas iniciativas de predição de reatividade cruzada baseadas nas sequências dos peptídeos apresentados (Frankild, 2008; De Groot, 2013), mas a compreensão e predição destes padrões de resposta têm se mostrado um desafio muito complexo.

Em um estudo publicado em 2008, uma equipe coordenada pelos pesquisadores alemães Heiner Wedemeyer e Markus Cornberg imunizou um indivíduo saudável com a vacina experimental IC41 (Fytili e cols., 2008). Esta vacina continha um epitopo imunogênico da proteína NS3 do Vírus da Hepatite C (HCV-NS3₁₀₇₃), cuja sequência de aminoácidos era “CINGVCWTV”. Conforme esperado, a vacina induziu a geração de CTLs específicos para este alvo. Em seguida, os pesquisadores recuperaram estes linfócitos e os desafiaram in vitro contra 28 variantes naturais do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, cobrindo os seis genótipos de HCV. A resposta contra a sequência selvagem “CVNGVCWT” do Genótipo 1 (G1-01), que apresenta alta reatividade cruzada com o epitopo vacinal, foi considerada o controle positivo. De acordo com os autores, foi observada uma importante reatividade cruzada com os alvos dos genótipos 4, 5 e 6, bem como com algumas variantes do genótipo 1. Por outro lado, uma fraca resposta foi observada contra os alvos dos genótipos 2 e 3. Em especial, o epitopo G3-18 (“TVGDVMWTV”) foi o único que aboliu completamente o reconhecimento pelos CTLs utilizados no ensaio (Figura 1A).

Figura 1. Comparação entre resultados in vitro e a análise estrutural in silico. (A) Resultados de um ensaio in vitro realizado por Fytili e cols., 2008, no qual uma mesma população de CTLs – específica contra a sequência selvagem do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃ - foi desafiada contra 28 variantes naturais deste alvo. (B-I) Recorte da área de interação com o TCR de alguns destes epitopos, no contexto do HLA-A*02:01, após modelagem pela técnica D1-EM-D2 (Antunes e cols., 2010). Áreas carregadas são apresentadas em azul (positivas) e vermelho (negativas), em uma escala de -10 kT a +10 kT. Complexos com forte reatividade cruzada apresentam grande semelhança estrutural (B-E), enquanto complexos com fraca resposta cruzada (F-I) apresentam diferenças no potencial eletrostático (setas verdes). Modificado de Antunes e cols., 2011.

Conforme apresentado na segunda parte deste post, o nosso grupo desenvolveu uma abordagem para a predição estrutural de complexos pMHC e começou a observar a distribuição do potencial eletrostático na superfície destes complexos. Em um trabalho publicado em 2011, foi realizada a modelagem destes 28 complexos apresentando variantes de HCV no contexto do MHC humano HLA-A*02:01 (Antunes e cols., 2011). Observando a superfície destes complexos, ficou clara a semelhança estrutural entre aqueles que apresentavam reatividade cruzada, em termos de topografia e distribuição de cargas (Figura 1B-E). Por outro lado, os complexos com fraca resposta cruzada apresentavam diferenças no potencial eletrostático, o que era especialmente visível no caso do complexo G3-18 (Figura 1I).

Na tentativa de quantificar estas relações de similaridade, nós delimitamos uma região nas imagens dos complexos e extraímos valores relativos ao histograma de cores (RGB). Estes valores foram utilizados como entrada para uma análise de componentes principais (PCA) que foi capaz de reproduzir os agrupamentos observados in vitro (Figura 2). Observe que, de acordo com o PC1 (que explica a maior parte da variabilidade dos dados), foi possível agrupar todos os complexos do genótipo 3 (G3) em um determinada faixa de valores. Os complexos do genótipo 2 ocupam outra faixa, na qual também se encontram os “mau-respondedores” do genótipo 1. Todos os complexos que apresentaram elevada reatividade cruzada se agrupam em uma faixa distinta, dominada pelos complexos do genótipo 6. Nós também incluímos nesta análise um epitopo de Influenza (IV-NA₂₃₁), cuja reatividade cruzada com o HCV-NS3₁₀₇₃ havia sido descrita previamente (Wedemeyer e cols., 2001), observando que o mesmo se localiza ao lado do epitopo selvagem de HCV.

Figura 2. Distribuição dos complexos de acordo com uma Análise de Componentes Principais (PCA). O único complexo que não apresentou resposta in vitro aparece completamente isolado (G3-18). A distribuição de acordo com o PC1 permite observar faixas que agrupam os complexos do genótipo 3 (G3), os complexos do genótipo 2 (G2) e os complexos do genótipo 6 (G6). O epitopo IV-NA₂₃₁, previamente descrito como alvo de reatividade cruzada com o epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, também se localizou junto ao grupo G6. Modificado de Antunes e cols., 2011.

        Os mesmos resultados foram observados utilizando-se outra abordagem estatística, a análise de clusterização hierárquica (HCA). O HCA também apresentava algumas vantagens práticas para a análise de um volume maior de dados, fornecendo um dendrograma das relações de similaridade entre os complexos. Foi então realizada uma triagem virtual de 55 complexos pMHC não relacionados, incluindo os pMHCs “cross-reativos” de HCV, mas também vários outros pMHCs disponíveis no CrossTope. Para esta abordagem foram utilizados valores de 7 regiões de variabilidade na superfície do pMHC (compatíveis com os footprints dos TCRs), os quais serviram para agrupar os complexos através do HCA (Antunes e cols., 2011).

Conforme esperado, o dendrograma resultante apresentou um agrupamento principal contendo as variantes de HCV. No entanto, este “cluster de HCV” incluía novos complexos. Dois deles se destacaram pela semelhança estrutural com o HCV-NS3₁₀₇₃: o HIV-GAG₇₇ (SLYNTVATL) e o EBV-LMP2₃₂₉ (LLWTLVVLL). Observe que o epitopo de EBV não compartilha nenhum aminoácido com o epitopo selvagem de HCV e que, no entanto, apresentou uma superfície muito semelhante no contexto do HLA-A*02:01. A possível reatividade cruzada entre HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉ não havia sido descrita e este alvo dificilmente teria sido sugerido por qualquer análise baseada em sequência.

Intrigados por nossa predição, o grupo do Professor Markus Cornberg resolveu testar estes alvos, utilizando estimulação ex vivo de linfócitos de pacientes HCV+ e avaliando o reconhecimento dos peptídeos através da marcação intracelular de Interferon-γ e citometria de fluxo. Estes estudos, ainda não publicados, confirmaram a reatividade cruzada entre os alvos HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉, apresentando importantes implicações para o estudo da evolução da infecção por HCV (Zhang, S., comunicação pessoal).

Encerramos assim esta jornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI). Nos próximos posts abordarei outras novidades desta nova fronteira da Imunologia, a “Imunoinformática”. Um Feliz dia dos Namorados a todos (especialmente à Stertz, L.) e boa sorte para a seleção brasileira que estreia hoje no mundial de 2014!!

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Imunologia molecular In silico – Parte II

 A Imunoinformática Estrutural

Conforme apresentado na primeira parte deste post, em 2009 o NBLI teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates. O grupo recebeu um auxílio de U$ 100.000 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I), voltado à identificação de padrões estruturais nestes complexos. No ano seguinte, o NBLI publicou um trabalho descrevendo padrões estruturais apresentados pelos epitopos quando complexados à fenda do MHC (Antunes e cols., 2010), padrão este que não era dependente da sequência do epitopo e que era específico para cada alotipo1 de MHC (Figura 1).

Figura 1. Exemplo da sobreposição de epitopos cristalografados na fenda de MHCs murinos. As estruturas de cinco epitopos restritos a H2-D^b (1CE6, 1S7V, 1WBZ, 1ZHB e 3BUY) e cinco epitopos restritos a H2-K^b (1FO0, 1FZJ, 1LK2, 1RJY e 1S7R) foram sobrepostas. (A) Visão lateral salientando as diferenças conformacionais apresentadas por epitopos no contexto do H2-D^b (vermelho) e do H2-K^b (azul), especialmente entre as posições 5 e 7 (p5-7). (B) Visão superior. (C) Sobreposição de duas estruturas cristalográficas (1S7V e 1S7R) apresentando o mesmo epitopo (KAVYNLATM) no contexto destes dois alotipos distintos. Modificado de Antunes e cols., 2010.

   

      Este trabalho foi realizado a partir da análise de todas as estruturas de pMHCs até então determinadas experimentalmente para alguns dos alotipos de MHC de classe I mais estudados (H2-D^b, H2-K^b, HLA-A*02:01 e HLA-B*27:05), disponíveis no ProteinData Bank. Além do caráter descritivo, a identificação destes padrões permitiu o desenvolvimento de uma nova estratégia de predição de estruturas  de pMHC-I. Trabalhos recentes têm utilizado ferramentas de ancoramento molecular (docking) para a predição estrutural de complexos pMHC (Bordner, 2006; Antunes, 2010; Khan, 2010). O docking é amplamente utilizado para predizer o modo de ligação de fármacos e pequenos ligantes ao sítio ativo de enzimas e receptores proteicos, apresentando resultados rápidos e confiáveis (Morris, 2009; Trott, 2010). No entanto, sua acurácia decai rapidamente com o aumento do número de ligações flexíveis do ligante, o que aumenta o número de conformações possíveis e eleva o custo computacional para a resolução do problema (Chang e cols., 2010). Enquanto a maioria dos algoritmos disponíveis apresenta resultados confiáveis para o ancoramento molecular de ligantes com até 10 ligações flexíveis, um peptídeo típico (apresentado por MHC de classe I) possui cerca de 9 aminoácidos e pode apresentar mais de 40 ligações flexíveis. Neste contexto, a descoberta de padrões conformacionais específicos para cada alotipo de MHC viabiliza o docking de complexos pMHC-I, na medida em que permite reduzir o número de ligações flexíveis do ligante. Esta foi a premissa utilizada no desenvolvimento de uma nova estratégia de predição estrutural de complexos pMHC-I, referida como D1-EM-D2 (Figura 2).

Figura 2. Fluxograma da abordagem D1-EM-D2. A estrutura de um dado complexo pMHC-I, cuja estrutura ainda não é conhecida, pode ser modelada em três etapas: (i) Docking, (ii) Energy Minimization e (iii) Docking (D1-EM-D2). A sequência linear de aminoácidos de um peptídeo pode ser utilizada como entrada para um script do PyMOL (a), o qual gera um arquivo de coordenadas espaciais (PDB) para o epitopo alvo, ajustando a conformação da cadeia principal ao padrão “alotipo-específico”. Uma estrutura de referência contendo o alotipo de interesse é utilizada como “Doador de MHC”, removendo-se o peptídeo da fenda. O “Doador de MHC” e o “Epitopo 3D” são utilizados como entrada para o ancoramento molecular (docking) com o Autodock Vina (b), gerando um novo pMHC-I. Um ciclo de otimização da estrutura é realizado para ajustar o “Doador de MHC” ao novo epitopo. Modificado de Sinigaglia e cols., 2013.

Mesmo considerando-se apenas os genes clássicos de MHC em humanos (HLA-A, HLA-B e HLA-C)2, já são descritos mais de 8.000 alelos3, dos quais uma parcela insignificante possui estrutura conhecida. Cada um destes alelos codifica a cadeia pesada de um alotipo de MHC capaz de apresentar milhares de peptídeos, muitos dos quais seriam de grande interesse para estudos de imunologia (variantes virais, autoantígenos, epitopos que apresentam reatividade-cruzada, etc). Muitos avanços foram feitos no campo da Cristalografia de Raios-X e da Ressonância Magnética Nuclear, permitindo a determinação experimental de um número cada vez maior de estruturas proteicas. No entanto, estes métodos continuam sendo extremamente caros e demorados. Assim sendo, considerando-se a magnitude e a variabilidade deste sistema, análises estruturais em larga escala de complexos pMHC-I seriam praticamente inviáveis sem o auxílio de métodos in silico, rápidos, precisos e de baixo custo.

A abordagem D1-EM-D2 foi amplamente validada em comparação com estruturas cristalográficas, sendo então aplicada na predição em larga escala de complexos pMHC-I apresentando peptídeos imunogênicos. Estes complexos foram posteriormente disponibilizados em um banco de dados específico, o CrossTope (Sinigaglia, 2013). Juntamente com o arquivo contendo as coordenadas espaciais do complexo, o CrossTope disponibiliza informações sobre o alelo de MHC, a proteína e o organismo de origem do epitopo apresentado, etc. São fornecidos links para bancos com informações complementares, como o IEDB e o NCBI. Além disso, o banco fornece uma imagem do potencial eletrostático sobre a superfície do pMHC que fará contato com o TCR. Estudos recentes indicam que características estruturais desta superfície, como cargas e topografia, podem direcionar o reconhecimento pelos linfócitos T CD8+ (Sandalova, 2005; Antunes, 2011; Shen, 2013). De acordo com resultados in vitro, mesmo a troca de um único aminoácido pode abortar o reconhecimento por uma dada população de linfócitos (Fytili, 2008).

Figura 3. Potencial eletrostático na superfície de interação com o TCR. A imagem mostra a vista superior de três complexos pMHC formados por variantes de um mesmo epitopo (com trocas por alanina), no contexto do HLA-A*02:01. Observe a posição dos domínios α1  e α2 do MHC, entre os quais se localiza o epitopo. Regiões com cargas positivas (azuis) e negativas (vermelhas) são representadas em uma escala de -5 kT a +5 kT. As superfícies de complexos que estimulam altos níveis de IFN-gamma frente a uma população de linfócitos específica contra o tipo selvagem (CVNGVCWTV) são muito semelhantes (A e B), enquanto diferenças de topografia e cargas (setas verdes) são visíveis na superfície de um complexo que estimula fracamente a mesma população de linfócitos (C). Modificado de Antunes e cols., 2010.

Além de continuar trabalhando no aperfeiçoamento e automatização da abordagem para predição estrutural de complexos pMHC-I, nosso grupo tem especial interesse na predição de reatividade-cruzada entre epitopos virais. Na terceira e última parte deste post, serão apresentados resultados referentes ao uso de estatísticas multivariadas para a triagem virtual de complexos pMHC-I. Esta abordagem baseada em estrutura nos permitiu predizer uma reatividade-cruzada até então desconhecida, entre epitopos que não compartilhavam nenhum aminoácido em sua sequência, um resultado que já está sendo confirmado por experimentos in vitro.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

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1 A expressão “alelos de MHC” é usualmente utilizada para referenciar tanto as variantes dos genes quanto as diferentes proteínas codificadas por estas variantes gênicas. No entanto, este segundo uso da expressão não é adequado uma vez que o termo “alelo” se refere especificamente a DNA, não a proteína. A expressão “alotipo” é indicada para referenciar as diferentes proteínas codificadas por alelos de MHC.

2 A cadeia pesada do complexo responsável pela apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular é referida genericamente como MHC de classe I (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), mas a nomenclatura varia de acordo com a espécie. Por exemplo, em humanos ele recebe o nome HLA (na sigla em inglês para Human Leukocyte Antigen), em camundongos é referido como antígeno H2, etc.

3 Até as 14 horas de Quarta-Feira, dia 07/05/2014, havia 8.124 alelos de MHC de classe I listados no http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html.

Imunologia molecular In silico – Parte I

Buscando padrões em sequências virais

O Professor José Artur Bogo Chies coordena o Laboratório de Imunogenética da UFRGS, localizado no Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, onde desenvolve pesquisas com enfoque nas análises genéticas de doenças com fundo autoimune e pró-inflamatório. Durante uma aula sobre apresentação de antígenos, para uma turma da graduação, foi surpreendido pela pergunta de um aluno sobre as características que permitiam ao sistema imune diferenciar próprio e não próprio.  Gustavo Fioravanti Vieira, então aluno do curso de Biologia, estava intrigado sobre o reconhecimento de peptídeos virais apresentados no contexto do MHC-I. Além da questão da seleção tímica e da possível influência do contexto inflamatório da infecção, haveria algum padrão nestes pequenos peptídeos apresentados pelas células infectadas que pudesse servir como uma “assinatura” típica de vírus? Afinal, as proteínas virais são formadas pelos mesmos 20 aminoácidos essenciais que formam as proteínas do hospedeiro e o linfócito CD8+ irá interagir com uma sequência de apenas 8-10 aminoácidos para “identificar” se o alvo apresentado é próprio ou não próprio. 

Figura 1. Rota de apresentação de peptídeos endógenos. Modificado de Yewdell e cols., 2003.

Muitos meses mais tarde, este despretensioso debate em sala de aula deu origem a uma nova linha de pesquisa no Laboratório de Imunogenética. O Professor José Artur convidou o ex-aluno (agora Bacharel em Biologia) para ingressar em um projeto de mestrado realizando uma análise in silico (no computador) das sequências de peptídeos virais imunogênicos. Sob co-orientação do Dr. Andrés Delgado Cañedo (Unipampa), Gustavo Vieira iniciou uma pesquisa voltada a identificação de padrões físico-químicos que pudessem ser responsáveis pelo desencadeamento de reatividade cruzada nas respostas celulares citotóxicas (Vieira & Chies, 2005). A existência de padrões físico-químicos que contribuíam para a ocorrência da reatividade cruzada entre epitopos virais foi posteriormente corroborada por experimentos realizados por pesquisadores dinamarqueses (Frankild e cols., 2008).

O projeto de Mestrado foi transformado em Tese de Doutorado e através do uso da ferramenta BLAST e de preditores das etapas da via de apresentação de antígenos endógenos foi possível identificar que os epitopos imunogênicos estavam restritos a regiões conservadas das proteínas virais (Rigo e cols., 2012). Ou seja, utilizando a proteína N dos Hantavírus como modelo de estudo, observou-se in silico que o sistema imunológico dos hospedeiros (roedores) direcionava a resposta celular contra epitopos compartilhados entre os diversos membros da família Bunyaviridae (blocos azul escuro na Figura 2). Estas sequências, por outro lado, não compartilhavam nenhuma similaridade com sequências do hospedeiro ou mesmo com sequências de outros organismos (mesmo considerando padrões físico-químicos). Estas observações são suportadas pela comparação entre a proteína N e proteínas da ordem Rodentia (hospedeiros naturais dos hantavírus) através de um sistema de janela deslizante, bem como por uma busca de motifs utilizando a ferramenta Pattern Search (Max Planck Institute). Assim sendo, a estimulação da resposta celular por estes alvos conservados potencializa a chance de imunização heteróloga (infecção pelo vírus “A” protege contra o vírus “B”) e reduz o risco de respostas autoimunes.

Figura 2. Alinhamento da proteína de nucleocapsídeo de 34 virus da família Bunyaviridae. Os blocos  acima do alinhamento indicam a localização de epitopos descritos em murinos (azul escuro) ou humanos (azul claro). Na parte superior da imagem a identidade é indicada por um histograma de cores, no qual o verde indica 100% de identidade. Observe que os epitopos murinos (hospedeiro natural) se encontram em blocos com identidade mais alta do que aquela observada para alguns epitopos descritos em humanos. Modificado de Rigo e cols., 2012.

Neste “contexto imunológico” se desenvolveu o Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI), coordenado por Gustavo Fioravanti Vieira, agora Professor Colaborador do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGBM-UFRGS). Com o tempo, o enfoque das pesquisas do grupo voltou-se da análise de sequências para a análise de estruturas, mantendo sempre o interesse central nos mecanismos da reatividade cruzada e da imunidade heteróloga. Em 2009 o grupo teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates, tendo recebido um auxílio de U$ 100.000,00 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I). Os resultados desta nova linha de pesquisa serão apresentados na segunda parte deste post.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Organelas celulares na reposta antiviral

Fonte: Viral Defense: It Takes Two MAVS to Tango.

A imunidade à vírus é um assunto extremamente interessante que, devido à importância dos surtos de infecções virais, vem ganhando muito espaço ultimamente nos “high impact journals”.

Esse ano a Cell publicou um trabalho belíssimo que descreve a importância dos peroxisomas na sinalização para uma resposta viral.

Já sabíamos que o reconhecimento intracelular de vírus de RNA ocorre por meio de receptores RIG-I-like (RLRs), que são helicases solúveis que detectam material genético viral. Entre os RLRs bem caracterizados, estão as proteínas RIG-I e MDA-5, que reconhecem RNA de fita dupla e sinalizam via uma molécula adaptadora chamada MAVS (ou IPS-1), para a produção de interferon do tipo I.

Interessante que MAVS tem um domínio transmembrana, fica ancorada na mitocôndria celular e recruta os RLRs que foram ativados por RNA viral. Isso por sí já é fantástico, visto que ilustra que as organelas celulares podem participar de vias de transdução de sinal. Geralmente os esquemas simplistas contidos nas revisões nos levam a pensar que as vias de transdução de sinal ocorrem isoladas e em um grande “buraco negro”chamado citoplasma.

Além do papel da Mitocôndria, o trabalho do John mostra que os Peroxisomos tem função importante na sinalização por RLRs durante uma resposta anti-viral. MAVS fica ancorada nos peroxisomas e induz uma primeira ativação rápida a partir dessa organela. Posteriormente, uma resposta mais duradoura ocorre a partir do MAVS ancorados nas mitocôndrias. Assim, o trabalho ilustra não somente que organelas celulares participam das vias de sinalização, mas também que essas organelas não são somente “metabólicas”, mas participam efetivamente da resposta imune contra patógenos.
Belo, não? Baseado nesse artigo e no nosso congresso de 2010, alguém se anima a estudar imunidade a vírus? Sem dúvida é uma área super importante e que pouca gente estuda no Brasil.