Na rota para uma ferramenta de predição de reatividade cruzada

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Em posts anteriores eu apresentei trabalhos desenvolvidos pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI/UFRGS), com foco na análise estrutural de complexos peptídeo:MHC (pMHC) e na predição de reatividade cruzada de linfócitos T (imunologia in silico, imunidade heteróloga). O grupo continua desenvolvendo esta linha de pesquisa, aprimorando uma metodologia para agrupar alvos virais com base na similaridade estrutural no contexto do MHC. Complexos pMHC estruturalmente semelhantes, apresentam maior probabilidade de ativar uma mesma população de linfócitos e, por outro lado, esta probabilidade é muito baixa para complexos muito diferentes. 

Em sua publicação mais recente (Mendes et. al, 2015), o grupo descreve uma versão aprimorada desta metodologia. Inicialmente, a estrutura dos alvos de interesse é predita, no contexto do MHC, utilizando uma metodologia baseada em ancoramento molecular (docking). Avaliando cristais de complexos TCRpMHC, o grupo identificou uma série de resíduos frequentemente envolvidos no reconhecimento dos alvos de linfócitos T, informação que foi utilizada para guiar a análise dos complexos modelados. Estes resíduos conservados, ou "regiões de interesse", foram utilizados para extrair dados estruturais, como área de acessibilidade ao solvente e potencial eletrostático na superfície molecular. Uma vez extraídos, estes dados foram utilizados em uma análise de agrupamento hierárquico (HCA, do inglês Hierarchical Cluster Analysis), revelando os complexos mais semelhantes. Outra inovação neste trabalho, diz respeito ao uso do pacote pvclust (linguagem R) para a geração do HCA. Além de realizar o agrupamento, este pacote fornece duas medidas de confiabilidade (bootstrap) para cada nó da árvore, permitindo a fácil identificação dos agrupamentos mais confiáveis. 

Neste estudo piloto, foram avaliados um conjunto de alvos do vírus da Dengue e um grupo de epitopos de HCV.  Este conjunto de HCV já havia sido abordado em trabalhos anteriores, permitindo a comparação direta com a nova metodologia. O resultados são coerentes com dados experimentais e oferecem uma forma inovadora de prospectar candidatos a reatividade cruzada (Figura 1), com implicações diretas para o desenvolvimento de vacinas. 

A etapa de modelagem dos complexos demanda maiores recursos computacionais e é realizada utilizando um protocolo próprio, mas o grupo está nas etapas finais de desenvolvimento de uma ferramenta automatizada e gratuita. O desafio seguinte diz respeito a aplicação desta técnica em larga escala, para modelagem e análise de redes de reatividade cruzada previamente descritas em trabalhos experimentais. Estes resultados serão utilizados para refinar a técnica de agrupamento baseado em estrutura e permitir o futuro desenvolvimento de uma ferramenta de predição de reatividade cruzada.

Figura 1. Agrupamento hierárquico de alvos virais no contexto do MHC humano HLA-A*02:01. Este conjunto inclui 8 alvos de Dengue e 28 alvos de HCV. No caso da Dengue, reatividade cruzada foi confirmada entre alvos da proteína NS4b. No caso do HCV, reatividade cruzada foi observada entre o tipo selvagem (G1.01) e variantes dos genótipos 4, 5 e 6 (ex.: G4.21, G5.22 e G6.28). De acordo com dados experimentais, o genótipo 1 incluía alguns indivíduos que não apresentavam reatividade cruzada com o tipo selvagem (ex.: G1.04). Modificado de Mendes et. al, 2015.

Infecções prévias com vírus heterólogos alteram a resposta individual à vacinação

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Figura 1.: Rede de reatividade cruzada envolvendo o alvo vacinal HCV-NS31073. Similaridade estrutural no contexto do MHC foi indicada como possível mecanismo para o desencadeamento de imunidade heteróloga, enquanto variabilidade individual e direcionalidade nas respostas observadas foram atribuídas ao histórico de infecções e o repertório privado de linfócitos T (Zhang e cols., 2015).

  A influência de infecções prévias sobre a resposta a novos desafios imunológicos não é nenhuma novidade para os imunologistas. O processo de imunização altera a composição do conjunto de linfócitos de memória de modo que algumas populações são expandidas, em detrimento de outras (Welsh & Selin, 2002). A imunidade heteróloga entre vírus parece ter um papel central neste contexto, sendo por sua vez moldada pelo repertório privado (individual) de linfócitos T CD8+ e por eventos de reatividade cruzada no reconhecimento de complexos peptideo:MHC (Welsh e cols., 2010). 

 Apesar de estes mecanismos serem reconhecidos, ainda nos surpreende quando respostas específicas para determinado alvo viral são encontradas em indivíduos que não tiveram exposição prévia a este patógeno. Pode uma simples gripe ou uma virose transmitida pelo beijo gerar algum nível de imunidade contra o Vírus da Hepatite C (HCV), por exemplo? Por mais incrível que pareça, eventos desta natureza já foram relatados em trabalhos prévios (Wedemeyer e cols., 2001), sendo provavelmente mais frequentes do que imaginávamos (Selin e cols., 2011). Em um trabalho recentemente publicado no Journal of Virology, Zhang e colaboradores (2015) descrevem a presença de linfócitos específicos para um alvo imunogênico de HCV (NS31073) em um terço dos indivíduos soronegativos para para este vírus, independente de fatores de risco para exposição a HCV. Análises ex vivo indicaram a presença tanto de células virgens quanto de células de memória, sugerindo que pelo menos uma parcela da resposta deve ser mediada por linfócitos originalmente expandidos na presença de vírus heterólogos (Figura 1).

  Uma análise de bioinformática estrutural (utilizando metodologia previamente descrita no SBlogI) sugeriu diferentes epitopos virais (derivados de EBV, CMV e Influenza) como possíveis alvos de reatividade cruzada, predições estas confirmadas em pelo menos uma parcela dos indivíduos. Cabe salientar que um destes alvos, EBV-LMP2329 (LLWTLVVLL), não apresenta qualquer similaridade de sequência com o epitopo HCV-NS31073 (CINGVCWTV), mas apresenta grande similaridade estrutural no contexto do MHC (Figura 2).

Figura 2.: Recorte da superfície dos complexos peptídeo:MHC, apresentando diferentes peptídeos virais no contexto da mesma molécula de MHC (HLA-A*02:01). Os domínios alfa-1 e alfa-2 da molécula de MHC, que flanqueiam o epitopo, são indicados. As cores indicam a distribuição do potencial eletrostático na superfície (vermelho = negativo, azul = positivo, branco = neutro). Neste conjunto, os alvos EBV-K1217 e EBV-BARF0356 apresentaram maior diferença em termos de potencial eletrostático (comparação utilizando agrupamento hierárquico). Alvos apresentando maior similaridade estrutural com o peptídeo vacinal de HCV (NS31073), considerando a superfície de interação com o TCR, foram selecionados para testes in vitro e respostas cruzada foram observadas em uma parcela dos indivíduos testados.

  O epitopo HCV-NS31073  foi previamente incluído na composição de uma vacina experimental anti-HCV, a qual foi utilizada por Zhang e colaboradores (2015) para imunizar indivíduos saudáveis. Acompanhando este grupo vacinado, os autores observaram resposta mais intensa e mais rápida nos indivíduos que apresentavam linfócitos específicos para HCV-NS31073 previamente a vacinação. Em conjunto, estes dados reforçam a hipótese de que a existência de células T "cross-reativas" previamente a imunização seja uma das variáveis responsáveis pela variabilidade individual à vacinação. A reatividade cruzada de células T parece ser mais comum do que previamente estimado, sendo possível até mesmo entre epitopos com baixa similaridade de sequência e podendo envolver diferentes alvos virais. Em conjunto com a variabilidade individual para a produção de linfócitos T (repertório privado), o histórico de infecções aumenta a variabilidade individual da resposta a vacinas e aponta para a necessidade de estratégias personalizadas. Outra questão importante se refere a "qualidade" desta resposta cruzada e a capacidade de estabelecer uma imunidade protetora, visto que respostas cruzadas fracas podem mediar infecção crônica e imunopatologia (Selin e cols., 2011, Wlodarczyk e cols., 2013).

  Embora vacinas personalizadas e avaliações em larga-escala do histórico pessoal de infecções virais ainda não sejam uma realidade, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas neste sentido. Uma publicação recente da revista Science descreve uma nova abordagem - rápida e barata - para detectar o histórico de infecções virais de um indivíduo (veja artigo do The Guardian). Metodologias como esta podem ter grande impacto no diagnóstico de doenças, na descoberta de novas associações entre infecções virais e a progressão de diferentes patologias humanas, bem como no desenvolvimento de vacinas mais seguras e mais eficientes.