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segunda-feira, 25 de março de 2013

Os Futuros da Imunologia e da Citometria


Olá Pessoal, gostaria de agradecer o convite para participar deste fórum e, para aqueles que me conhecem, já sabem que nosso assunto inicial não poderia escapar da área de citometria de fluxo.
A história da citometria moderna começa na década de 50 quando os irmãos Coulter aplicaram o princípio que leva o mesmo nome e desenvolveram um equipamento capaz de medir tamanho e granulosidade celular, que mais tarde evoluiu e deu origem aos primeiros analisadores hematológicos comerciais. Desde então, a citometria de fluxo tem progredido de forma prodigiosa em termos de possibilidades de medição multiparamétrica celular. Atualmente é possível realizar ensaios biológicos que permitem a quantificação de várias proteínas/estruturas de superfície e intracelulares, quantificação de DNA e de cromossomos, influxo de Cálcio, atividade metabólica e até mesmo associações entre moléculas pela técnica da FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer). E o melhor disso tudo é que muitas destas marcações e aplicações podem ser feitas ao mesmo tempo.
A partir de meados da década de 60 foi criado, na Universidade de Münster (Alemanha), o primeiro citômetro baseado em fluorescência, o ICP 11 da PARTEC. No mesmo período outro grupo liderado por Leonard Herzenberg desenvolveu um aparelho capaz de separar células de acordo com a expressão de proteínas de superfície, que eram reconhecidas por anticorpos conjugados à fluorocromos. Foi assim então que nasceu o termo FACS (Fluorescence-Activated Cell Sorter). Este avanço tecnológico foi importantíssimo para desenvolvimento das áreas de Imunologia, Biologias Celular e Molecular e em especial para a pesquisa com células tronco. Desde então os maiores avanços na área de citometria foram a adição de novos fluorocromos e lasers que permitiram que chegássemos aos atuais 20 parâmetros presentes em alguns equipamentos comerciais top de linha: 18 “cores” + tamanho e granulosidade celular. Não se martirize caso seu citômetro permita apenas 3, 5 ou 7 fluorescências, pois o analisador supra citado possui cinco lasers e só é comercializado mediante encomenda (SOP-Special Order Product).
Mas a tecnologia mais usada atualmente tem um limite: o espectro de emissão dos fluorocromos atuais é muito curto (que compreende basicamente o espectro visível + UV e Infravermelho) o que limita o número de fluorescências que podem ser medidas concomitantemente, bem como adição de novos fluorocromos pode alterar o overlap espectral, causando uma dor de cabeça na hora da compensação. Mas e aí, o que fazer então?
No intuito de vencer estas limitações, alguns visionários investiram recursos em novas tecnologias que não se limitavam ao uso dos fluorocromos convencionais, testando assim outros detectores ou moléculas que não os próprios fluorocromos. Neste sentido podemos destacar o uso de algumas tecnologias como o espectro de Raman, que baseia-se no princípio de que a excitação de um dado fluorocromo provoca uma ressonância molecular específica. Assim e em consequência desta característica cada fluorocromo possuiria um padrão de ressonância específica ou uma assinatura espectral. Esta tecnologia já está disponível apesar de não ser muito divulgada/utilizada1.
Outra tentativa de se avançar no campo da separação celular é o uso de citometria por microfluidos. Neste caso o princípio utilizado é o da manipulação e visualização celular em ambiente confinado (chip) onde as gotas contendo as células são envoltas por uma camada de óleo (sheath fluid). Esta tecnologia é muito poderosa pois possibilita a formação de microculturas de células, onde o número e o tipo celular presente em cada microgotícula pode ser controlado. Além disso, este método possui a vantagem de ser mais seguro quando do uso de amostras com potencial de perigo biológico. (http://www.youtube.com/watch?v=66Oc8fLKXlE&list=PLA775C11CC11611CA). Neste caso, as maiores limitações do método são a velocidade de separação ou análise (baixa) e o entupimento do chip.
Talvez a mais animadora tentativa de se expandir as fronteiras da análise multiparamétrica seja o uso da citometria de massa (CyTOF® Mass Cytometer – DVS Sciences2,3). Esta tecnologia, que diga-se de passagem já esta disponível comercialmente, é na minha opinião uma das maiores promessas para o futuro da citometria de fluxo. Ao invés de utilizar fluorocromos conjugados a anticorpos, esta técnica utiliza a espectrometria de massa atômica de 33 tipos de metais (que fazem a função dos fluorocromos) e dois intercalantes de DNA. Com o uso de isótopos destes metais é possível aumentar para até 100 o número de sinais e, portanto, o número de parâmetros a serem analisados. Mas aí nos deparamos com a grande questão: será que minha pesquisa comporta a busca por 100 marcadores diferentes? Bom se você ainda não está neste estágio hoje, pode ser que esteja em um futuro próximo. Por outro lado, você economizaria tempo e dinheiro, evitando aquela confusão de 10 marcações diferentes com 30 tubos por marcação. Mais ainda, esta técnica é muito interessante para aqueles pesquisadores que possuem uma quantidade muito limitada de material, e neste caso poderiam testar todos os seus marcadores com o uso de uma única amostra.
Se isso servir como estímulo para futuros investimentos conheço dois pesquisadores, um em Singapura e outro em Nova Iorque, que já compraram os seus.

Referências:
1- A flow cytometer for the measurement of Raman spectra. Cytometry A. 2008 Feb;73(2):119-28. doi: 10.1002/cyto.a.20520. Watson DA, Brown LO, Gaskill DF, Naivar M, Graves SW, Doorn SK, Nolan JP.
2-From single cells to deep phenotypes in cancer. Nature Biotechnology. 2012 30,639–647 doi:10.1038/nbt.2283. Sean C Bendall & Garry P Nolan.
3-Single-Cell Mass Cytometry of Differential Immune and Drug Responses Across a Human Hematopoietic Continuum. Science 6 May 2011. Vol. 332 no. 6030 pp. 687-696 DOI: 10.1126/science.1198704. Sean C. Bendall et. al. 

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10 comentários:

  1. Marcos Grisotto, também conhecido como Pira, é o mais novo colaborador do blog, escrevendo diretamente de São Luis, Maranhão. Bem-vindo!

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  2. Obrigado Cris, foi muito legal, espero ter contribuído. Grande abraço.

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  3. Daniel De Carvalho25 de março de 2013 21:02

    Oi Pira.
    O CyTOF é sem duvida a melhor tecnologia para análise multiparamétrica. Nós temos um aqui, já que a tecnologia foi desenvolvida literalmente no prédio vizinho do nosso. Algums pontos:
    O CyTOF tem a grande vantagem de não precisar "compensar", já que não é baseado em fluorcromos, não há interferencia entre uma "cor" e a outra.
    Apesar de teoricamente se conseguir mais de 100 parametros, na pratica o máx são ~42.
    Outro ponto complicado é fazer o label dos anticorpos (ja existem diversos disponíveis comercialmente).
    Um ponto importante tb é que não permite fazer sorting, já que as células são vaporizadas. Por isso o aparelho tb perde aproximadamente 2/3 das células, não permitindo análises em um numero pequeno de células.
    Outro ponto importante do CyTOF é a necessidade maior de recursos de bioinformatica, já que produz uma quantidade muito maior de dados. Já existem algumas ferramentas específicas para o CyTOF, como o SPADE.
    De qualquer forma é uma tecnologia excepcional para fazer screenings e acho que vai revolucionar bastante a imunologia. Outro dia assisti uma palestra do grupo do Nolan e eles tinham dados muito interessante com células de memória...
    Na minha opinião, é uma tecnologia que vale a pena investir.

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    1. Obrigado Daniel pela complementação do post. Realmente fica difícil de colocar tudo em perspectiva, mas acho que vc pontuou bem os prós e contras do Cytof. A intenção do artigo foi justamente dar uma visão alternativa do que podemos fazer com citometria. Muito obrigado por sua colaboração. Grande abraço, Pira.

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  4. Salve Pira,

    Em uma perspectiva historica, algo que acho interessante é a parte que a separação por gotas carregadas eletricamente foi uma aplicação alternativa para a tecnologia nascente, na época e muito comum hoje em dia: impressão por jato de tinta.

    Associação entre moléculas, também já existem descrições de precipitação com beads seguida de revelação com secundário, tipo o que normalmente se faz em géis.

    Uma curiosidade: sabe me falar se existe alguma ligação entre GP Nolan do Cytof (Stanford) e o JP Nolan do espectro de Raman (Los Alamos)?

    Abraço

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  5. Caro Walter,

    Posso te dizer que Garry e o John se parecem, mas não sei te dizer se são irmãos. O Garry P. é professor/pesquisador na Stanford Schhol of Medicine (gnolan@stanford.edu) no laboratório de mesmo nome no Centro de Proetômica. Já o John P. está desde 2004 no La Jolla Bioengineering Institute, La Jolla, CA (858) 456-7500 ramal 110 e foi o presidente da International Society for Advancement of Cytometry (ISAC)até 2012. Um abraço. Pira

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    Respostas
    1. Desculpe, em meu comentário cometi um erro: eu lembrava que o trabalho com Espectro de raman tinha ligação com Los Alamos (que na época eu achei interessante, normalmente eu ligo esse laboratório ao Projeto Manhattan, por razões históricas, mas eles vão muito além...), mas são outros autores, Nolan já estava em La Jolla na época.

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  6. Belo Post Pira! Obrigado pelos ensinamentos.

    Abraços, André

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  7. Grande Andre,

    Valeu meu amigo, muitas saudades, quem sabe a gente se ve este ano em Natal. Grande abraco.

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  8. Grande Andre,

    Valeu meu amigo, muitas saudades, quem sabe a gente se ve este ano em Natal. Grande abraco.

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