O papel da microbiota intestinal na proteção contra a malária

Vitor R. R. de Mendonça

O grupo do Miguel Soares novamente nos surpreende com uma publicação de alto impacto. Saindo um pouco do tema (via de metabolismo do heme) normalmente pesquisado por este grupo de Portugal, Yilmaz e colaboradores tentam explicar o papel da microbiota intestinal na produção de anticorpos protetores contra a malária em modelo experimental e em uma coorte de indivíduos infectados pelo Plasmodium falciparum no Mali. 

Seres humanos não expressam o glicano Galα1-3Galβ1-4GlcNAc-R (α-gal) e possuem baixos níveis de anticorpos anti-α-gal em resposta a bactérias da microbiota intestinal, como a Klebsiella spp., Serratia spp., e Escherichia coli spp. Yilmaz et al. demonstrou que o P. falciparum, P. berghei e P. yoelli também expressam a α-gal e a produção de anticorpos anti-α-gal por indivíduos de uma região endêmica está associada a proteção contra a transmissão da malária.

Camundongos knockouts para o gene produtor da α-gal (UDP-galactose:β-galactoside-α1-3-galactosiltransferase) colonizados com a bactéria E. coli O86:B7, que expressa este glicano, produziram anticorpos IgM anti-α-gal com proteção a malária de modo similar ao observado nos indivíduos da área endêmica. Em ensaios de imunização com membranas de eritrócitos de coelho expressando α-gal ou α-gal sintético conjugado com BSA (bovine serum albumin), observou-se proteção quando os esporozoítos eram inoculados na pele, não acontecendo quando os mesmos eram inoculados na corrente sanguínea, sugerindo que o efeito protetor dos anticorpos anti-α-gal é exercido na derme. Além disso, o provável mecanismo de ação dessa proteção é por citotoxicidade mediada pelo complemento visto que camundongos knockout para o C3 perderam este efeito protetor. 

Vale ressaltar que, quando infectados, todos os camundongos tiveram malária cerebral experimental. Sugerindo, desta forma, que a imunização com a α-gal protege contra a transmissão da malária, mas não é eficaz na proteção contra formas graves da doença caso a infecção pelo Plasmodium ocorra. Adicionalmente, os anticorpos estarem abaixo do limiar necessário é a provável explicação dos autores sobre a proteção estéril observada em camundongos pelos anticorpos anti-α-gal não ser vista em seres humanos.

A proteção dos anticorpos anti-α-gal pode também ser importante em outros protozoários expressando a  α-gal , como a Leishmania spp. e o Trypanosoma spp., mas ainda permanece desconhecido. A comunidade cientifica agradece mais um artigo interessante sobre malária do Instituto Gulbenkian de Ciência. Sugiro a leitura para maiores detalhes. 

Referência:

Yilmaz B, Portugal S, Tran TM, et al. Gut Microbiota Elicits a Protective Immune Response against Malaria Transmission. Cell 2014;159(6):1277-1289. doi:10.1016/j.cell.2014.10.053.

Tolerância clínica na malária, papel da subpopulação Vdelta2+ dos linfócitos T gama-delta

Fig. 1. Decline in malaria episodes and an increase in asymptomatic parasitemia.

 Em muitas infecções a forma assintomática ocorre por tempo variável e pode ser seguida do desenvolvimento das formas sintomáticas, as manifestações clínicas da doença. Na malária, a forma assintomática sucede múltiplas manifestações sintomáticas. Após múltiplos episódios de malária, o indivíduo modula a resposta que leva às manifestações clínicas mesmo que não consiga a eliminação do Plasmodium. Este controle das manifestações clínicas (forma assintomática) sem imunidade esterilizante caracteriza a imunidade clínica. O entendimento dos mecanismos que levam à forma assintomática é necessário para um melhor manejo dos pacientes com malária. Este conhecimento é também importante pois pode levar ao desenvolvimento de vacinas anti-doença. Vários estudos têm demonstrado alguns mecanismos envolvidos.

Um estudo recente na Science Translational Medicine (Jagannathan et al., Loss and dysfunction of Vδ2+ γδ T cells are associated with clinical tolerance to malaria. Sci. Transl. Med. Vol 6 Issue 251 251ra117, 2014) que as formas assintomáticas estão associadas a uma redução de número das células Vδ2+ γδ e da resposta destas células aos antígenos do Plasmodium (redução da proliferação e da produção de citocinas com aumento da expressão de gens reguladores). Os dados são significativos, principalmente se levado em conta que estas células pró-inflamatórias sofrem uma rápida expansão na malária de indivíduos sem exposição prévia.

Recomendo a leitura (aqui, se vc tem acesso permitido), DOI 10.1126/scitranslmed.3009793.

Novas contribuições na imunologia na malária no início de 2014

Schematic representation of the proposed sequence of events occurring in the liver after Plasmodium infection do artigo Nature Medicine,  (2013). doi:10.1038/nm.3424.

A malária talvez seja a doença parasitária com maior financiamento à pesquisa, pelo que chama a atenção que dois artigos recentes no tema da imunologia desta enfermidade, em revistas de grande prestígio, salientem:

"There is a general consensus that the development of new intervention strategies is hampered by the current limited understanding of the biology of Plasmodium species and of the complex relationships that the parasite maintains with its hosts". (1)

"Additional control measures, including a vaccine, are sorely needed in these settings, but progress has been limited by our lack of understanding of immunologic correlates of exposure and protection." (2)

Ainda mais importante, assim, destacar os avanços demonstrados nestes artigos.

O artigo do grupo de Maria Mota (Host-cell sensors for Plasmodium activate innate immunity against liver-stage infection)¹ demonstra, no modelo experimental murino de infecção pelo Plasmodium berghei, a indução de IFN Tipo I durante o estágio hepático, o qual se pensava silencioso para o sistema imune. O RNA do Plasmodium, que não era um PAMP (pathogen-associated molecular pattern) listado entre os indutores de resposta IFN tipo I, é capaz de estimular através do Mda5. Esta resposta iniciada pelas células residentes no fígado é propagada pelos hepatócitos com participação de receptores para IFN-a/b. Esta via de sinalização de IFN tipo I parece ser fundamental para a resistência ao estágio hepático contra o Plasmodium. 

No caso do artigo de Jagannathan e cols (IFNc/IL-10 Co-producing Cell” Dominate the CD4 Response to Malaria in Highly Exposed Children)² eles caracterizaram, por citometria de fluxo multiparamétrica, a resposta dos linfócitos T Plasmodium-específicos em crianças de Uganda participantes de um estudo de coorte longitudinal. Por ser um estudo deste tipo, eles avaliaram a produção de IFN-g, TNF-a e IL-10 em relação à resposta passada e após a ocorrência de malária. A resposta CD4+ foi observada em todas as crianças, com a maioria delas exibindo linfócitos T CD4+ que produziam tanto IFN-g quanto IL-10 em resposta a hemácias infectadas por Plasmodium.  A frequência destas células co-produtoras de IFN-g e IL-10 foi maior nas crianças com mais de 2  ou mais episódios/ano (comparada com as crianças com menos de 2 episódios) e se correlacionou inversamente com a duração da malária. Um ponto importante é que feito o ajuste para incidência prévia de malária a frequência de linfócitos duplo produtores de IFNg e IL-10 não está associada com proteção. 

Um outro ponto importante se refere às células produtoras de TNF, que não se correlacionaram com proteção, mas a sua ausência está associada à infecção assintomática.  A elevada frequência de linfócitos T CD4+ co-produtores de IFN-g e de IL-10 é uma observação importante para futuros estudos.

A demonstração do papel da resposta mediada por IFN tipo I na etapa hepática da infecção é um dado novo na compreensão da resposta imune contra o Plasmodium e com amplas possibilidades de avançar novas abordagens de proteção contra malária. Já a observação da importância dos linfócitos T CD4+ produtores de IFN-g/IL-10, embora não tão inovadora, é também importante no quadro complexo da imuno-regulação da malária humana.

Avançamos, mas ainda temos um longo caminho pela frente.

1.  Nature Medicine,  (2013). doi:10.1038/nm.3424

 2. PLoS Pathog  (2014) doi:10.1371/journal.ppat.1003864

We can go further: Systems Immunology

Vitor R R de Mendonça

Com a Biologia de Sistemas em voga no cenário da pesquisa mundial, o ramo da Imunologia de Sistemas surge nos últimos anos de modo tímido e promissor. A comunidade científica está cada vez mais exigente e a explicação da resposta imune a diversas doenças requer não mais uma descrição de fatores isolados e independentes, mas de uma visão de vias de modo integral e global. Desta forma, a Imunologia de Sistemas visa entender e predizer interações imune complexas através da integração e análise por bioinformática de dados gerados através de experimentos moleculares e celulares de grande output.  Como exemplos de ferramentas desta área, observa-se a expressão de RNA “genome-wide”, análise de citocinas por multiplex, citometria de fluxo policromática, caracterização de anticorpos por conjunto de proteínas, e metabolômica. 

Pode-se dividir o estudo da Imunologia de Sistemas através das análises da expressão gênica (RNA), dos produtos genéticos (proteínas, metabólitos, anticorpos), e do fenótipo e função celular. A partir do conhecimento do genoma humano, novas técnicas permitem quantificar os níveis dos transcritos de RNAm para cada gene humano conhecido em apenas um experimento. A caracterização “genome-wide” da expressão gênica é uma etapa importante para entender o funcionamento global da biologia de sistemas. Os métodos mais utilizados para este fim são os de hibridização (microarrays ou beads microscópicas) e o mais avançado e recente sequenciamento amplo do genoma (RNA-seq). Os transcritos de RNA são apenas uma parte do complexo sistema que também inclui proteínas (citocinas, quimiocinas, anticorpos e moléculas de superfície) e metabólitos, que moldam a qualidade da resposta imune. Idealmente, todas as proteínas induzidas na resposta imune poderiam ser diretamente dosadas do que confiar nas mensurações por RNA, mas isso não é possível com a tecnologia proteômica atual. Desta maneira, experimentos multiplex para quantificação de proteínas têm sido empregados para validar a expressão proteica de genes selecionados e focar naqueles de particular interesse.  Para análise do fenótipo celular, a citometria de fluxo tem sido bastante usada, apesar do pequeno número de fluorescências limitar a análise de muitos subtipos celulares. 

No que se refere à malária, poucos estudos demonstraram a importância da análise de expressão “genome-wide” na resposta imune em indivíduos infectados pelo Plasmodium falciparum. Estes trabalhos possibilitaram a identificação de perfis de expressão gênica associadas com uma maior susceptibilidade à malária, vias de sinalização importantes envolvendo TLRs e IFN-gama em modelos experimentais, e diferenças na resposta imune em indivíduos experimentalmente infectados daqueles naturalmente infectados e residentes da área endêmica. Em uma próxima etapa, vai ser crucial incrementar estes estudos pioneiros através da aplicação de todas as ferramentas da Imunologia de Sistemas disponíveis em estudos longitudinais robustos para melhor caracterização da resposta imune contra o plasmódio.

A Imunologia de Sistemas representa uma possível ferramenta de análise integrada que pode ajudar a desvendar o sistema imune e o seu funcionamento em resposta a diversas patologias, através de uma visão dinâmica e sistemática. Contudo, limitações, como a disponilidade da tecnologia restrita a poucos centros de pesquisa no mundo, tornam o estudo por sistemas mais complicado. Maiores informações podem ser encontradas na brilhante revisão recentemente publicado por Tran e colaboradores (2012).

Tran TM, Samal B, Kirkness E, Crompton PD. Systems immunology of human malaria. Trends Parasitol. 2012 Jun;28(6):248-57.

Figura acima do post retirada do trabalho acima.

Mosquitos transgênicos com ativação do seu sistema imune inato são resistentes à infecção por Plasmodium

Post de Vitor R R de Mendonça

Vacinas eficazes contra a malária humana permanecem sob investigações científicas, sem uma perspectiva concreta de sucesso a curto prazo.  Muitas das abordagens vacinais são dirigidas para aumentar a resposta imune do hospedeiro contra o Plasmodium.  Por outro lado, alguns pesquisadores têm dado atenção especial ao controle da infecção através do vetor do plasmódio, o mosquito do gênero Anopheles.  

O grupo do Prof. Marcelo Jacobs-Lorena tem feito diversas contribuições sobre manipulação dos vetores com potencial aplicação no controle da malária:

Dinglasan, R.R. et al., 2007. Disruption of Plasmodium falciparum development by antibodies against a conserved mosquito midgut antigen. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104(33), pp.13461–13466.

Yoshida, S. et al., 2007. Hemolytic C-type lectin CEL-III from sea cucumber expressed in transgenic mosquitoes impairs malaria parasite development. PLoS Pathogens, 3(12), p.e192.

Fang, W. et al., 2011. Development of transgenic fungi that kill human malaria parasites in mosquitoes. Science, 331(6020), pp.1074–1077.

Recentemente publicado na Plos Pathogens, o artigo de Dong et al. também discorre sobre Anopheles transgênicos resistentes à infecção pelo Plasmodium.

O sistema imune inato do Anopheles é capaz de produzir diversos fatores imunes anti-Plasmodium identificados como TEP1, APL1, LRPD7, e FBN9, sendo todos controlados pela via do IMD através do fator de transcrição Rel2. No estudo supracitado, pela primeira vez, pesquisadores desenvolveram mosquitos geneticamente modificados da espécie Anopheles stephensi que expressavam altos níveis da forma ativa da Rel2 através de promotores indutores suplementados na alimentação (repasto sanguíneo): carboxylpeptidase (Cp) ou vitellogenin (Vg). Gerou-se, desta forma, linhas transgênicas Cp-Rel2 e Vg-Rel2, assim como um híbrido com expressão de Rel2 tanto nos tecidos do intestino médio (Cp) quanto no tecido adiposo (Vg). As três linhagens de mosquitos demonstraram potente atividade anti-Plasmodium falciparum, além de resistência à infecção pelas bactérias gram negativas. Quando os mosquitos foram alimentados com cultura de gametócitos de P. falciparum, a intensidade da infecção por oocistos se reduziu nas 3 linhagens quando comparados com o genótipo selvagem (redução de 77,1%, 48,6% e 82,9% nos insetos Cp-Rel2, Vg-Rel2 e híbrido, respectivamente). O Cp-Rel2 e o híbrido foram mais resistentes à infecção do que a linha específica para o tecido adiposo (Vg-Rel2), sugerindo que o parasita é mais susceptível ao ataque imune através da ativação da via IMD no intestino médio pela Rel2 mediada pela carboxypeptidase. Estes dados foram confirmados visto que as linhagens Cp-Rel2 e híbrido expressando Rel2 recombinante no intestino médio diminuíram o estágio de oocito do parasita antes da invasão do epitélio intestinal, enquanto que a Vg-Rel2 apenas demonstrou uma maior capacidade de inibir os estágios do Plasmodium após a invasão. Os autores também ratificaram que o transgene Rel2 confere resistência ao plasmódio através da ativação de múltiplos genes efetores (TEP1, ALP1, LRRD7) já que o silenciamento de cada um desses genes em separado não resultou em aumento da taxa de infecção.

Estudos, sob condições laboratoriais, desses mosquitos demonstraram apenas um fraco impacto negativo da expressão transgênica na longevidade e fecundidade do inseto. Vale ressaltar que o método utilizado na produção dos transgênicos não envolve a introdução de genes recombinantes externos, mas a potencialização do sistema imune do mosquito através da expressão aumentada do fator de transcrição Rel2 através de promotores presentes na alimentação. 

Pioneiros em seu estudo, Dong et al. sugeriram uma possível alternativa para o controle da malária através do controle do sistema imune do vetor. Contudo, outros estudos serão necessários para ratificar os resultados demonstrados e verificar a biodisponibilidade e possível impacto ambiental da introdução da suplementação com promotores de Rel2 na dieta de Anopheles na natureza.

Referência: 

Dong Y, Das S, Cirimotich C, Souza-Neto JA, McLean KJ, et al. (2011) Engineered Anopheles Immunity to Plasmodium Infection. PLoS Pathog 7 (12): e1002458.