Journal Club IBA: TH17 cells transdifferentiate into regulatory T cells during resolution of inflammation

As células Th17 são caracterizadas pela produção de IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL21 e pela expressão do fator de transcrição RORγT.  Essas células estão envolvidas na proteção contra bactérias extracelulares e fungos, além de desempenharem importante papel na patogênese de doenças autoimunes, como esclerose múltipla, psoríase e artrite reumatoide. Interessantemente, o desenvolvimento de células Th17 e células T reguladoras (T reguladoras FOXP3⁺ induzidas ou Tr1 produtoras de IL-10) é interconectado, sendo ambos dependentes de TGF-β. Portanto, o balanço entre esses tipos de células influencia o desenvolvimento de respostas inflamatórias à antígenos estranhos ou próprios, de modo que o desequilíbrio na relação células Th17/T reguladoras pode estar relacionado ao desenvolvimento de doenças autoimunes, inflamação crônica e tolerância a patógenos. Além disso, estudos recentes demonstraram que as células Th17, dependendo do microambiente, podem se diferenciar (in vitro e in vivo) em células produtoras de IL-10, além de coexpressar RORγT e FOXP3⁺, enquanto células T reguladoras também podem se tornar produtoras de IL-17. Contudo, não é conhecido se a plasticidade das células Th17/T reguladoras reflete apenas uma mudança no perfil de citocinas produzidas ou se essas células sofrem um processo de transdiferenciação, ou seja, sofrem reprogramação de um tipo de celular para outro. (1,2,3)

Com o intuito de avaliar a transdiferenciação de células Th17 para um perfil regulador in vivo, foi utilizado o modelo animal chamado Fate⁺, que consiste no cruzamento de um animal IL-17A repórter (IL-17A^CRE x Rosa26 STOP^fl/fl YFP (R26^YFP)) com o animal triplo repórter IL-17A^Katushka IL-10^eGFP Foxp3^RFP. O animal resultante Fate⁺, após a expressão de Il17a, deleta o cassete R26^YFP e está marcado permanentemente pela expressão de YFP. A construção de tal modelo possibilitou aos pesquisadores testar a expressão de IL-17A, IL-10 e Foxp3 em células YFP⁺, de forma ex vivo sem a necessidade de novo estímulo in vitro.

                  Foi realizado um experimento utilizando anticorpo monoclonal anti-CD3 (anti-CD3 mAb) nos animais, com o intuito de mimetizar uma resposta inflamatória, pois anti-CD3 mAb causa uma resposta inflamatória autolimitante nos animais. Foi observada expansão da população de células Th17, seguida pelo aumento de células IL-17A^Katushka- YFP+ (denominadas ExTh17), sendo que porção destas células também expressavam IL-10^eGFP e que foram então denominadas TR1^ExTh17(IL-17A^Katushka- YFP⁺ IL-10^eGFP).

Os autores propuseram então 2 modelos para explicar a formação de células TR1^ExTh17 durante uma resposta imune, sendo que o primeiro modelo defende a ideia de que células Th17 podem sofrer conversão para células TR1 em situações basais e que durante a resposta imune ocorreria a expansão desses grupos de células. O segundo modelo propõe que as células Th17 podem sofrer a conversão para TR1 durante o curso de uma resposta imunológica. Para averiguar qual dos dois modelos estava acontecendo, foi gerado um animal chamado iFate, no qual as células Th17 só se tornam YFP⁺ após tratamento com a droga tamoxifeno. Com o uso dessa estratégia foi possível perceber que o segundo modelo proposto é o mais adequado, pois células Th17 sofrem conversão para TR1 durante o decorrer da resposta imune.

O próximo aspecto avaliado foi se as células TR1^ExTh17 sofriam reprogramação transcricional durante a conversão de Th17 para TR1. Foi realizado sequenciamento do transcriptoma de diversas populações celulares provenientes do animal Fate⁺ (Th17, ExTh17, Foxp3, Foxp3^IL-10+, TR1 e TR1^ExTh17) e foi construída uma matriz de correlação, onde pode-se verificar a semelhança entre a expressão global de 97 genes selecionados como relevantes para o perfil Th17. Dessa forma foi possível constatar que células TR1^ExTh17 possuem maior semelhança com relação ao perfil transcricional de células TR1, do que quando comparada com qualquer outro tipo analisado. O mesmo tipo de análise foi realizado, focando agora no perfil de expressão de 191 genes relacionados ao perfil de citocinas. Novamente células TR1^ExTh17 possuem maior semelhança com relação ao perfil transcricional de células TR1, do que quando comparado com qualquer outro tipo analisado. Pode-se concluir que a conversão de células Th17 para TR1 é determinada e/ou acompanhada por uma reprogramação do perfil transcricional, um processo que já foi descrito como transdiferenciação. (4, 5)  

Para testar se as células TR1^ExTh17 haviam realmente completado sua transdiferenciação funcional de Th17 para TR1, foi utilizado um modelo de colite mediado pela transferência de células Th17 patogênicas (pTh17) geradas in vitro, na presença de anti-CD3 mAb, IL-6, IL-23, TGF-β, anti-IFN-γ e anti-IL-4. Animais Rag^-/^- receberam essas células pTh17, juntamente com células Th17, ExTh17, TR1 e TR1^ExTh17, provenientes de animais Fate⁺. Foi possível constatar que células TR1^ExTh17 realmente completaram sua reprogramação funcional, pois foram capazes de prevenir a colite mediada por células pTh17.

Foi utilizado também um modelo animal de esclerose múltipla experimental (EAE), para verificar se células Th17 derivadas de uma resposta autoimune seriam capazes de realizar a conversão para células regulatórias. Os experimentos demonstraram que mesmo células ExTh17 desenvolvidas durante resposta autoimune são capazes de realizar a conversão para células TR1. Além disso, células específicas para o antígeno envolvido na EAE foram capazes de expressar maiores níveis de IL-10 do que células não específicas para o antígeno.

Na tentativa de elucidar possíveis vias envolvidas na conversão de Th17 para TR1 foram analisados genes relevantes para perfil Th17 que se encontravam induzidos em células ExTh17 e TR1^ExTh17 nas análises de sequenciamento do transcriptoma. Essa análise revelou associação com a via de sinalização de TGF-β. Em experimentos realizados pelo grupo foi possível observar que TGF-β promove plasticidade de células Th17 e conversão para TR1, de forma dose-dependente. De acordo com Martinez et al. (6), dentre as moléculas envolvidas na via de sinalização de TGF-β, Smad3 diminui atividade de RORγt, consequentemente reduzindo o desenvolvimento de células Th17. Quando os autores bloquearam Smad3 utilizando um inibidor durante a diferenciação in vitro de Th17, ocorreu a diminuição da indução de células TR1^ExTh17. Tais resultados indicam que TGF-β, possivelmente através de Smad3, promove a conversão de Th17 para TR1.

Existem evidências na literatura de que células Th17 e TR1 diferenciadas na presença de TGF-β expressam altos níveis de AhR, que promove ativação de Il10 (7). Para avaliar se a ativação de AhR influencia a conversão de Th17 para TR1, foram realizadas culturas celulares contendo o agonista do receptor AhR (FICZ) e antagonista desse mesmo receptor. Foi observado que a presença de FICZ aumentou consideravelmente o desenvolvimento de células TR1^ExTh17, enquanto a presença do antagonista reduziu a conversão de Th17 para TR1.  

De forma geral, esse estudo demonstrou que células Th17 são capazes de sofrer transdiferenciação para o perfil TR1 durante o desenvolvimento da resposta imune na presença de TGF-β, sendo que ativação de AhR promove a conversão.

Figura 1. Células Th17, partindo de um perfil inflamatório inicial, são capazes de sofrer transdiferenciação para o perfil TR1 (anti-inflamatório) durante o decorrer da resposta imune na presença de TGF-β, através de Smad3 e com a ativação do receptor AhR, que promove a conversão Th17-TR1. As células TR1 que sofreram transdiferenciação são capazes de produzir IL-10.

Referências Bibliográficas

1.    Noack, M.; Miossec P. Th17 and regulatory T cell balance in autoimmune and inflammatory diseases. Autoimmun Rev. 13,  668-677 (2014).

2.    Hirota,K. et al. Fatemapping of IL-17-producing T cells ininflammatory responses.Nature Immunol. 12, 255–263 (2011).

3.    Komatsu,N. et al.Heterogeneity of natural Foxp31 T cells: a committed regulatory T-cell lineage andanuncommittedminor population retaining plasticity.Proc.Natl Acad. Sci. USA 106, 1903–1908 (2009).

4.    Graf, T. & Enver, T. Forcing cells to change lineages. Nature 462, 587–594 (2009).

5.    Komatsu,N. et al. Heterogeneity of natural Foxp31 T cells: a committed regulatory T-cell lineage andanuncommittedminor population retaining plasticity. Proc.Natl Acad. Sci. USA 106, 1903–1908 (2009).

6.    Martinez, G. J. et al. Smad3 differentially regulates the induction of regulatory and inflammatory T cell differentiation. J. Biol. Chem. 284, 35283–35286 (2009).

7.    Apetoh, L. et al. The aryl hydrocarbon receptor interacts with c-Maf to promote the differentiation of type 1 regulatory T cells induced by IL-27. Nature Immunol. 11, 854–861 (2010).