Estudo desvenda aspectos importantes para a compreensão da leishmaniose

Notícia publicada originalmente na edição online da Pesquisa Fapesp (aqui). Parabéns novamente ao Dario Zamboni e colaboradores pelo Nature Medicine genuinamente brasileiro.

Por Maria Guimarães, 9 de junho de 2013

© DARIO ZAMBONI / USP

Dois macrófagos (azul) expressando uma das moléculas do inflamassoma (verde) e infectados com Leishmania amazonensis (vermelho)

Um grupo de pesquisadores brasileiros que busca entender em detalhe os mecanismos de imunidade contra a leishmaniose acaba de conseguir uma contribuição importante. Dario Zamboni, da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo (USP) em Ribeirão Preto, e seus colaboradores mostraram o papel de um conjunto de proteínas chamado inflamassoma nessa batalha, em artigo publicado neste domingo (9/6) no site da Nature Medicine. O trabalho foi realizado inteiramente em seu laboratório no interior paulista, no âmbito de um projetodo Programa Jovens Pesquisadores da FAPESP.

A leishmaniose é uma doença silenciosa no que diz respeito à ativação do sistema imunológico. Os protozoários do gênero Leishmania que causam tanto a versão visceral como a tegumentar se alojam dentro das células sem matá-las, e não assolam o organismo inteiro como acontece em muitas infecções bacterianas. “Uma lesão cutânea de leishmaniose pode permanecer por meses sem cicatrizar”, conta o biólogo Dario Zamboni. Em parte por isso, Leishmania é um parasita pouco detectado pelo sistema imunológico.

Já se sabia que uma arma importante usada pelo sistema imunológico é o óxido nítrico, molécula que cumpre uma infinidade de funções no organismo, incluindo a defesa contra micróbios que causam doenças. “Ninguém sabia as vias de sinalização que levam à produção de óxido nítrico durante a leishmaniose”, explica o pesquisador. O estudo coordenado por ele examinou o efeito da infecção por Leishmania em células de defesa (macrófagos) de camundongo in vitro, e também nos animais vivos. Descobriram que a infecção induz a agregação, dentro das células dos roedores, das proteínas que formam o inflamassoma. Este, por sua vez, altera outra molécula importante do sistema imunológico, a interleucina 1-beta (IL-1β), tornando-a ativa. A IL-1β funciona como uma mensageira imunológica: sai da célula e circula até encontrar outra célula infectada, em cuja superfície se liga a receptores que desencadeiam a sinalização para a síntese de óxido nítrico.

O mecanismo funciona, o estudo mostrou, para as espécies Leishmania amazonensis eL. brasiliensis, causadoras da leishmaniose tegumentar, e L. infantum chagasi, responsável pela forma visceral da doença. Em L. major, menos comum no Brasil, o estudo mostrou que os parasitas ativam o inflamassoma, mas esse efeito não é necessário para controlar a infecção. Ainda não está claro o que está por trás dessa diferença.

Apesar de ter estudado apenas camundongos nesse trabalho, Zamboni acredita que o mesmo aconteça em seres humanos. “Outros estudos mostraram que mutações em genes que participam da sinalização por IL-1β também afetam a suscetibilidade à leishmaniose em seres humanos”, explica.

A esperança é contribuir para possíveis tratamentos, mas esse ainda é um objetivo distante no horizonte. Não haverá uma solução simples como cápsulas de IL-1β, inclusive porque desequilíbrios nos teores e no funcionamento dessa molécula estão por trás de uma série de doenças auto-inflamatórias. “Entender a doença, assim como os mecanismos de resistência, é fundamental para se desenvolver uma terapia racional e vacinas contra essa doença”, afirma Zamboni. Nesse caso, ele busca inspiração no que determina o sucesso – ou não – do próprio sistema imunológico nesse combate.

“O trabalho de Dario Zamboni e coautores é daqueles que desatam nós”, comenta Walter Colli, do Instituto de Química da USP (IQ-USP). “Muitos patógenos que infectam células do sistema imune sobrevivem no interior dessas células estabelecendo uma convivência, já que nem destroem o hospedeiro nem são por ele destruídos. O hospedeiro combate o invasor, controlando a infecção. É como se fosse estabelecido um equilíbrio que torna a doença de progressão lenta, ainda que sempre presente.” Em sua avaliação, o trabalho de Zamboni elucida esses mecanismos e dá um passo para compreender como o sistema imunológico combate esse e outros intrusos.

Colli ressalta que Zamboni faz parte de uma linha de pesquisa com destaque no Brasil: fez Iniciação Científica no laboratório de Isaac Roitman na Universidade de Brasília e doutorou-se sob a orientação de Michel Rabinovitch, na Universidade Federal de São Paulo (Unifesp). Depois de um pós-doutorado na Universidade Yale com Craig Roy, Zamboni se instalou na Faculdade de Medicina da USP de Ribeirão Preto. Dois alunos de Zamboni já foram agraciados com prêmios outorgados pela Sociedade Brasileira de Protozoologia (SBPz) por trabalhos apresentados sobre receptores intracelulares presentes nas células do sistema imune que participam da detecção e do controle deLeishmania e de Trypanosoma cruzi, um indício de que a escola de pensamento em que se formou continua a render frutos. “A lista de colaboradores de Zamboni mostra que, em algumas áreas, já temos massa crítica para atuar coletivamente com projetos ousados e inovadores que visem, mais do que a quantidade, a qualidade em nossa produção científica”, avalia o professor do IQ-USP.

Leishmania intracelular: uma vida "radical"

Post de Johan vanWeyenbergh

Uma revisão recente na revista «Free Radicals in Biology and Medicine» recapitula duas décadas repletas de literatura sobre as ameaças 'radicais' que a Leishmania enfrenta ao invadir a sua célula hospedeira, o macrófago. Apesar do destaque inicial do NO como 'serial killer' nas Leishmanias spp., além do seu aliado fiel o IFN tipo II, IFN-gama, nos últimos anos foram revelados o superóxido e o IFN tipo I, IFN-alpha/beta como protagonistas nesta historia. 

Um artigo publicado neste mês na prestigiosa FASEB J por de Carvalho et al. demonstra a produção do IFN-beta, dependente da PKR e da TLR2, no macrófago murino e humano infectado por Leishmania amazonensis. Por outro lado, o artigo confirma o papel deletério do IFN tipo I e da superoxido dismutase SOD1, demonstrado por nosso grupo no modelo humano e agora também no modelo murino por de Carvalho et al. Além do mais, com a demonstração do IFN-beta na própria lesão cutânea em pacientes com leishmaniose difusa, complementam perfeitamente o achado da SOD1 na lesão de pacientes com leishmaniose cutânea, confirmando o eixo IFN-beta/SOD1, ou por extenso PKR/IFN-beta/SOD1 na leishmaniose humana. 

A relevância clinica destes dados é imediata, já que o DETC, inibidor potente da SOD1, demonstrou marcante efeito leishmanicida no macrófago humano e murino in vitro, mas também in vivo no modelo murino, desafiando assim a hegemonia do NO como 'serial killer'. Por outro lado, a Leishmania também tem a sua própria superoxido dismutase, usada como principal arma de defesa na amastigota intracelular como mostrado recentemente por Bahrami et al., corroborando com os nossos dados de um efeito direto e irreversível do DETC na destruição da Leishmania até na sua forma extracelular. 

Em conclusão, o superoxido e o IFN tipo I se juntaram ao NO e o IFN tipo II na batalha Leishmania vs. macrófago e desta vez, quem sabe, o paciente poderia sair ganhando.

Referências:

1: de Carvalho Vivarini A, Pereira Rde M, Dias Teixeira KL, Calegari-Silva TC, Bellio M, Laurenti MD, Corbett CE, de Castro Gomes CM, Soares RP, Silva AM, Silveira FT, Lopes UG. Human cutaneous leishmaniasis: interferon-dependent expression of double-stranded RNA-dependent protein kinase (PKR) via TLR2. FASEB  J. 2011 Dec;25(12):4162-73. 

2: Van Assche T, Deschacht M, da Luz RA, Maes L, Cos P. Leishmania-macrophage interactions: insights into the redox biology. Free Radic Biol Med. 2011 Jul 15;51(2):337-51. 

3: Bahrami S, Hatam GR, Razavi M, Nazifi S. In vitro cultivation of axenic amastigotes and the comparison of antioxidant enzymes at different stages of Leishmania tropica. Trop Biomed. 2011 Aug;28(2):411-7. 

4: Khouri R, Novais F, Santana G, de Oliveira CI, Vannier dos Santos MA, Barral A, Barral-Netto M, Van Weyenbergh J. DETC induces Leishmania parasite killing in human in vitro and murine in vivo models: a promising therapeutic alternative in Leishmaniasis. PLoS One. 2010 Dec 21;5(12):e14394. 

5: Khouri R, Bafica A, Silva Mda P, Noronha A, Kolb JP, Wietzerbin J, Barral A, Barral-Netto M, Van Weyenbergh J. IFN-beta impairs superoxide-dependent parasite killing in human macrophages: evidence for a deleterious role of SOD1 in cutaneous leishmaniasis. J Immunol. 2009 Feb 15;182(4):2525-31. 

Plaquetas no recrutamento de monócitos na leishmaniose

Há aproximadamente 8 anos, em 2003, o Dr. Frederic Geissmann iniciava sua história na descrição de importantes subpopulações de monócitos murinos, em um belo trabalho publicado na Immunity. De lá para cá foram vários trabalhos em revistas como Science, JEM, Plos Medicine, dentre outras. Basicamente estas células foram diferenciadas umas das outras pela expressão de um marcador de superfície muito comum de neutrófilos, chamado GR1. Geissmann, na ocasião de seu pos-doutoramento na New York University, descreveu, junto ao Dr. Dan R. Littman que entre os monócitos murinos existiam duas subpopulações com funções e fenótipos diferentes. Os monócitos GR1 positivos foram caracterizados como inflamatórios pelo fato de migrarem para locais de estímulo inflamatório. Os GR1 negativos ou com baixa expressão desta molécula, foram descritos como monócitos residentes, por serem responsáveis pela substituição de macrófagos residentes em tecidos em homeostase. Mais tarde, em 2008, em um trabalho na Science, Geissmann mostrou que estas células também apresentam um comportamento muito interessante realizando o patrulhamento dos vasos sanguíneos, aderindo-se a eles e “engatinhando” sobre o endotélio mesmo contra o fluxo sanguíneo, a espera de um sinal de perigo. Assim, quando detectam este sinal, estes monócitos rapidamente adentram o tecido estimulado. E por isso foram chamados de monócitos patrulhadores. Após estes belos trabalhos, vários outros autores se enveredaram no estudo dos chamados monócitos inflamatórios, mostrando sua importância em infecções por Toxoplasma gondii, Brucella melitensis, West Nile virus, Leishmania spp., dentre outros. Dentre estes autores que resolveram se aventurar no estudo destas subpopulações, está o grupo do Dr. David Mosser, da University of Maryland, que já em 2007 publicou um trabalho com uma de suas pós-doutoras (Dalit Strauss-Ayalli), revisando a caracterização fenotípica destas populações, além de uma breve apresentação de resultados preliminares sobre a participação destes monócitos durante infecção por Leishmania major em camundongos. Dando continuidade então a estes trabalhos, estive no laboratório do Dr. Mosser por quase 3 anos e na semana passada publicamos o resultado dos nossos achados no Journal of Experimental Medicine. Neste trabalho descrevemos que a subpopulação de monócitos inflamatórios é capaz de migrar rapidamente a locais de infecção por L. major, como a cavidade peritoneal ou a pele, mesmo antes que neutrófilos. Nestes locais, estas células produzem grandes quantidades de espécies reativas de oxigênio sendo capazes de eliminar os parasitas em quase sua totalidade. O mais inusitado é o mecanismo pelo qual estas células são capazes de migrar em apenas meia hora para o local da infecção. A Leishmania após inoculada na pele, rapidamente ativa o complemento, que ativa plaquetas, que por sua vez se agregam umas as outras e também aos parasitas (veja o vídeo abaixo). As plaquetas ativadas liberam PDGF que ativa células ao redor da lesão, como fibroblastos, células do endotélio e da musculatura lisa, fazendo com que estas liberem rapidamente a quimiocina CCL2 (MCP-1) atraindo desta forma as células GR1+ para o local da infecção. Ensaios in vitro mostraram que as plaquetas são ativadas imediatamente após a exposição aos parasitas, na presença de soro contendo complemento, e que em 10 minutos já é possível a detecção de PDGF e CCL2 na pata de camundongos infectados com L. major. Sendo assim, descrevemos um importante papel para os monócitos inflamatórios durante a infecção por L. major, que inclui a participação de plaquetas e a rápida migração destas células para o local da infecção onde são capazes de, fagocitando ou não, matar os parasitas.

Goncalves R, Zhang X, Cohen H, Debrabant A, Mosser DM. Platelet activation attracts a subpopulation of effector monocytes to sites of Leishmania major infection. J Exp Med. 2011 May 24.

Post por Ricardo Gonçalves, professor visitante da Universidade Federal de Ouro Preto.