DockTope: Um portal gratuito e simples para a predição estrutural de complexos peptídeo-MHC

Autor: Dinler Amaral Antunes, Bacharel em Biomedicina pela UFRGS, Mestrado e Doutorado pelo PPGBM/UFRGS e pós-doutorado pela Rice University (Texas/EUA).

    O ancoramento molecular (ou docking) tem sido amplamente utilizado para predizer a estrutura de complexos proteína-ligante, tanto na academia quanto na indústria [1]. Existe uma grande diversidade de programas, oferecendo recursos para abordar diferentes problemas e diferentes níveis de flexibilidade do sistema [2]. Na imunologia, uma das mais interessantes aplicações do docking diz respeito a predição de complexos peptideo-MHC de classe I (pMHC-I) [3,4], um componente central para a resposta imunológica celular. Esta aplicação, no entanto, não é trivial.

    Para predizer a conformação mais provável de um ligante na fenda do receptor o programa de docking deve explorar todas as ligações flexíveis do ligante, bem como movimentos de rotação e translação. Na maioria dos casos o docking é aplicado para ligantes pequenos (até 10 ligações flexíveis), sendo que a acurácia e a performance das predições decai com o aumento da flexibilidade do ligante [5,6]. Ligantes peptídicos representam um desafio particular para o docking, uma vez que apresentam uma cadeia principal bastante flexível e cadeias laterais que podem também adotar uma diversidade de conformações. Um estudo recente salientou a limitação dos protocolos convencionais na predição estrutural de ligantes peptídicos com até 5 resíduos [7]. Estes dados salientam o enorme desafio referente a aplicação de ferramentas de docking à moléculas de MHC de classe I, uma vez que os ligantes envolvidos são peptídeos contendo entre 8 e 11 resíduos e mais de 35 ligações flexíveis.

    Tendo em vista a importância da análise estrutural de complexos pMHC-I e as limitações dos métodos experimentais para a resolução destas estruturas (sobretudo considerando-se a grande variabilidade deste sistema), diversas abordagens foram propostas para tentar viabilizar a predição estrutural in silico de complexos pMHC-I. Dentre os exemplos mais notáveis, eu saliento o trabalho pioneiro de Andrew Bordner [3,9], bem como as ferramentas DynaPred, MHCsim e pDOCK. Apesar de apresentarem sucesso em casos particulares, estas ferramentas possuem limitações importantes e na maioria dos casos envolvem o uso de diferentes softwares e até mesmo pacotes pagos. O único desta lista que foi disponibilizado na forma de um servidor online foi o MHCsim, que na verdade não realiza a predição por docking, mas apenas converte uma estrutura conhecida (cristal) no complexo de interesse ("mutando" as posições discordantes).

    Em 2010, um grupo da UFRGS publicou um protocolo para a predição estrutural de complexos pMHC-I combinando etapas de docking e minimização de energia [10]. O protocolo foi explicado em um post anterior aqui do blog. Assim como os métodos descritos anteriormente, este protocolo envolve uso de diferentes programas e uma série de etapas de preparação e conversão de arquivos, dificultando seu uso por outros pesquisadores. No entanto, um esforço foi feito para automatizar todas as etapas e implementar o protocolo em um servidor que pudesse ser acessado livremente, sem exigir do usuário qualquer conhecimento de bioinformática. Assim surgiu o DockTope, a nova alternativa para a predição estrutural de complexos pMHC-I. Basta escolher o alelo de MHC de interesse, fornecer a sequência do peptídeo e aguardar o resultado. A técnica depende da utilização de padrões estruturais compartilhados entre peptídeos apresentados por um mesmo alelo de MHC, os quais foram determinados para 4 alelos de MHC até o momento [10]. Apesar de existirem exceções a estes padrões, um artigo publicado recentemente na Scientific Reports demonstrou a robustez do método [4]. A técnica foi empregada na reprodução de 135 estruturas cristalográficas de complexos pMHC-I (não redundantes), apresentando um valor médio de RMSD para todos os átomos do ligante inferior a 2 Å (abaixo da resolução média dos cristais utilizados, Figura 1).

Figura 1. Valores médios de RMSD (Root Mean Square Deviation)
 para as 135 estruturas cristalográficas reproduzidas, considerando-se
carbono alfa (azul) ou todos os átomos do ligante (vermelho). Valores
médios de resolução dos cristais reproduzidos também são
apresentados (verde) para comparação.

    Além do sucesso na reprodução de estruturas cristalográficas, predições baseadas nos modelos gerados foram confirmadas com dados experimentais [11,12,13]. Com base na similaridade estrutural dos modelos de complexos pMHC-I foi possível predizer eventos de reatividade cruzada de linfócitos T, envolvendo peptídeos de diferentes vírus e com baixa similaridade de sequencia [13]. Estes dados reforçam a validade biológica dos modelos gerados, salientando a aplicabilidade deste método para o desenvolvimento de vacinas.

   O DockTope já está sendo aplicado em larga escala para modelar uma série de alvos (principalmente peptídeos virais) os quais estão sendo depositados em um banco de dados desenvolvido pela mesma equipe, o CrossTope [14]. Neste site o usuário pode pesquisar os complexos que já foram modelados e obter informações sobre o receptor e o ligante, bem como links para outros bancos de dados. Também é possível comparar complexos de interesse e observar o potencial eletrostático da superfície de interação com o TCR. Apesar de possibilitar a modelagem de um número restrito de alelos de MHC, o DockTope inclui justamente alelos de elevado interesse para os imunologistas. O HLA-A*02:01 é um dos mais frequentes alelos em humanos [15] e o alelo HLA-B*27:05 foi associado ao controle da infecção por HIV e HCV [16,17,18], bem como a eventos de autoimunidade (ex.: espondilite anquilosante) [19].

Limitações: Conforme mencionado anteriormente, já foram identificados alguns exemplos de exceções aos padrões utilizados para modelar a cadeia principal dos peptídeos [10]. Até o momento não é possível identificar com base na sequência se o alvo de interesse será uma destas exceções, então existe um erro associado a técnica. Este tipo de incerteza é comum a qualquer método de predição e os dados de reprodução de cristais mencionados anteriormente reforçam a ideia de que a técnica é bem sucedida na maioria dos casos, pelo menos para estes alelos (HLA-A*02:01, HLA-B*27:05, H2-Db, H2-Kb). É possível observar na Figura 1 que a média de RMSD das reproduções para HLA-B*27:05 foi mais alta que para os demais alelos, o que salienta a complexidade associada a flexibilidade do ligante. Peptídeos restritos a este alelo apresentam um conteúdo maior de argininas, as quais possuem longas cadeias laterais, sendo particularmente difíceis de predizer com acurácia. Nesta primeira fase, o DockTope não permite que o usuário modele múltiplos alvos ao mesmo tempo, o que dificulta a modelagem de um conjunto grande de complexos. Estas restrições devem ser flexibilizadas em um segundo momento, a medida que for confirmada a demanda pelo serviço. 

Predição da estabilidade dos complexos peptídeo:MHC e o "desprendimento" do ligante

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA

Figura 1. Ilustração de Eric Reits para representar a rota 
de apresentação de peptídeos endógenos. Uma amostra 
das proteínas intracelulares é processada e apresentada
na superfície celular no contexto do MHC-I, permitindo seu
 reconhecimento pelos linfócitos T (Yewdell et al., 2003).

    A apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular representa uma rota central para a resposta imunológica adaptativa. Este mecanismo, presente em praticamente todas as células nucleadas do organismo, possibilita que linfócitos T circulantes (CD8+) "fiscalizem" o conteúdo intracelular destas células apresentadoras, permitindo a detecção de infecções virais e tumores. Esta rota pode ser explicada de maneira simples, sendo visivelmente uma espécie de "controle de qualidade" do conteúdo intracelular (Figura 1). Os detalhes moleculares desta rota, no entanto, são bastante complexos e variáveis. Por exemplo, se tentarmos entender quais são os requisitos responsáveis pela capacidade de um peptídeo de desencadear a ativação de um linfócito, perceberemos o envolvimento de múltiplas variáveis relacionadas a diferentes etapas deste processo. Em primeiro lugar, o peptídeo precisa ser capaz de "sobreviver" ao processamento, uma vez que nem todos os possíveis peptídeos contidos em uma dada proteína são apresentados na superfície (Yewdell et al., 2003). Um ponto importante nesta etapa de processamento diz respeito a capacidade de ligação dos peptídeos gerados às moléculas de MHC de classe I (sigla em inglês para Complexo Principal de Histocompatibilidade). Hoje temos acesso a uma ampla coleção de dados sobre ligação de peptídeos a moléculas de MHC e é possível inclusive predizer a afinidade de ligação do complexo considerando-se as sequências das moléculas envolvidas (Backert & Kohlbacher, 2015; Karosiene et al., 2012). No final desta rota, o conjunto peptídeo:MHC (pMHC) poderá interagir com linfócitos circulantes e o desfecho da resposta dependerá de uma série de fatores envolvidos na afinidade da interação entre o pMHC e o receptor de linfócito T (ou TCR, na sigla em inglês). Em um capítulo de livro publicado em 2012 nós utilizamos o termo reatividade para nos referirmos a esta etapa final e os fatores envolvidos na ativação dos linfócitos T citotóxicos. No mesmo capítulo, nós discutimos a importância de um "nível de seleção" intermediário entre o processamento e a reatividade, relativo a estabilidade do complexo pMHC.
    Embora intuitivamente possamos imaginar que a estabilidade de um dado pMHC será um reflexo da afinidade de ligação do complexo, de modo que apenas pMHCs estáveis serão formados no retículo endoplasmático e consequentemente apresentados na superfície, esta relação nem sempre é observada. Na verdade, os dados sugerem que a estabilidade do pMHC é inclusive um melhor preditor da imunogenicidade do peptídeo do que a própria afinidade de ligação (van der Burg at al., 1996; Harndahl et al., 2012; Jorgensen et al. 2014). Embora os já conhecidos "resíduos âncoras" sejam primariamente envolvidos na afinidade do complexo, as cadeias laterais de outros resíduos secundários podem influenciar positivamente ou negativamente na manutenção do modo de ligação mais favorável, o que pode levar a instabilidade do complexo (Jorgensen et al. 2014). Isso acaba tendo impacto direto na possível estimulação de linfócitos, sobretudo considerando que uma diversidade de peptídeos está sendo apresentada ao mesmo tempo e que estes diferentes complexos pMHC estão competindo pela interação com o TCR; complexos mais numerosos e mais estáveis tem maior chance de serem reconhecidos (dependendo também dos fatores envolvidos na reatividade).

Figura 2. Visualização dos dados obtidos de uma dinâmica
 molecular de um complexo pMHC não estável. Os cones
verdes indicam a direção e a intensidade das forças
observadas em determinados resíduos. Neste exemplo,
elas indicam uma forte tendência de desprendimento
da porção C-terminal do ligante. Estes dados diferem
daqueles observados para um ligante controle. Modificado
 da Tese de Doutorado de Maurício M. Rigo (2015). 

    O servidor netMHCstab utiliza redes neurais para predizer a estabilidade de um dado complexo pMHC com base na análise de sequencias, tendo apresentado resultados promissores na identificação de epitopos de linfócito T quando combinado a um método consenso para predição de afinidade de ligação ao MHC (Jorgensen et al. 2014). No entanto, estes métodos baseados em análise de sequência são muito dependentes da qualidade e do volume de dados utilizado para treinar as predições (Wang et al., 2014). Esta restrição muitas vezes impede a generalização das predições para outros alelos de MHC ou outros tamanhos de ligantes, visto que os dados experimentais ainda são limitados para a maioria dos alelos (considerando-se apenas os MHCs de classe I clássicos, são mais de 10 mil alelos descritos em humanos). Métodos estruturais tem potencial para permitirem uma maior generalização das predições, especialmente considerando-se uma característica dinâmica como estabilidade. Em tese, tendo-se uma estrutura inicial do complexo é possível calcular as forças envolvidas na interação e simular o comportamento do complexo em solução. Durante seu trabalho de Doutorado desenvolvido na UFRGS, meu colega Maurício Menegatti Rigo utilizou métodos de docking e dinâmica molecular para estudar a estabilidade de ligantes na fenda do MHC. Utilizando dados obtidos de simulações considerando a real estrutura das moléculas envolvidas (full-atom MD) foi possível observar claros sinais de instabilidade em peptídeos mutados (Figura 2), além de identificar algumas interações que parecem ser mais importantes para a manutenção do modo de ligação.
    A dinâmica molecular é a ferramenta de bioinformática estrutural com a maior precisão em termos da correta descrição das forças envolvidas e das trajetórias moleculares preditas para um dado sistema. No entanto, esta precisão acarreta um elevado custo computacional que em muitos casos inviabiliza a análise de sistemas muito grandes, ou a observação de eventos que ocorrem em escalas de tempo superiores a centenas de microssegundos. O trabalho descrito acima corrobora o potencial preditivo da dinâmica molecular quanto a instabilidade do complexo, mas nestas simulações curtas (20 ns) não é possível observar o completo "desprendimento" do ligante. Na verdade, um trabalho recente demonstrou que o desprendimento completo pode não ser observado mesmo em uma dinâmica molecular de 1000 ns (1 µs), a mais longa simulação de um complexo pMHC já publicada (full-atom MD) (Knapp et al., 2015). Para conseguir observar este evento em nível molecular, os autores implementaram uma estratégia alternativa. Em primeiro lugar, ao invés de considerar a descrição atômica das moléculas envolvidas, eles utilizaram uma representação simplificada dos resíduos (coarse-grained 3-point model). Em segundo lugar, eles utilizaram um método de segmentação hierárquica da proteína para restringir a flexibilidade de grupos de resíduos, o que também melhora a performance (reduz graus de liberdade) e previne a perda do correto enovelamento da proteína (unfolding). Os movimentos neste sistema foram então explorados através do método de Monte Carlo. Finalmente, eles realizaram repetidas etapas de simulated annealing para permitir uma rápida exploração do espaço conformacional sem ficar restrito a mínimos locais de energia. Esta abordagem permitiu observar o completo desprendimento da fenda em um tempo computacionalmente viável (Figura 3) e foi capaz de discriminar entre ligantes e não ligantes (AROC = 0,85). Esta é a primeira vez em que são descritas conformações intermediárias do ligante durante o processo de desprendimento do MHC, possibilitando novos insights e revelando outros detalhes moleculares importantes para o desencadeamento de uma resposta imunológica celular. A capacidade de predizer dados experimentais corrobora a hipótese de que as simplificações realizadas não prejudicaram a correta descrição das moléculas simuladas, mas futuros experimentos serão necessários para determinar a real acurácia e a potencial generalização dos resultados observados.

Figura 3. Simulação do processo de desprendimento de um peptídeo da fenda do MHC utilizando (A) uma nova metodologia baseada em coarse-grained Monte Carlo e simulated annealing (HNMMC) ou (B) dinâmica molecular. O peptídeo utilizado (AAAKTPVIV) foi previamente descrito como não ligante de HLA-A*0201, alelo utilizado nestes experimentos. A técnica HNMMC foi capaz de descrever um completo desprendimento da fenda, em um tempo muito inferior ao da dinâmica molecular (C). Figura publicada em Knapp et al., 2015.

Engenharia de vetores virais: pesquisadores desenvolvem controle proteolítico da infecção.

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Apesar dos desafios técnicos e das frustrações com a lenta transição entre pesquisa básica e a sua aplicação no contexto de estudos clínicos, gradualmente a terapia gênica vem se consolidando como uma poderosa e versátil ferramenta, com uma infinidade de aplicações para a saúde humana (Wang et al., 2014). Neste contexto, vetores virais como as partículas adeno-associadas chamam atenção por suas características intrínsecas, como tropismo por diversos tecidos e baixa imunogenicidade (Zinn et al., 2014). No entanto, considerando a complexidade dos sistemas biológicos e os riscos envolvidos neste tipo de abordagem, o sucesso de uma terapia gênica usualmente depende da eficiente transferência do transgene especificamente para a população de células alvo. Este refinado controle do vetor viral exige algumas ferramentas que não estão naturalmente presentes nas partículas originais, mas que podem ser planejadas e adicionadas utilizando-se nanotecnolgia e bioengenharia (Guenther et al., 2014, Sen D., 2014).  

Um exemplo interessante de bioengenharia de vetor adeno-associado vem sendo desenvolvido pela equipe da pesquisadora norte-americana Junghae Suh (Judd et al., 2014). O esquema (esquerda/acima) descreve o mecanismo de modo simplificado, enquanto a figura (esquerda/abaixo) mostra a real estrutura da partícula modificada: proteínas representadas em cartoon, com o capsídio viral em azul e os peptídeos cliváveis em vermelho.

Resumidamente, os pesquisadores adicionaram à estrutura do capsídeo diversas cópias de um peptídeo negativamente carregado contendo uma sequência de clivagem, especificamente reconhecida por uma protease. Na ausência desta protease, o peptídeo serve como um "cadeado" que bloqueia a interação da partícula com receptores na superfície celular, impedindo a infecção e a consequente liberação do transgene. Na presença da protease, o peptídeo é clivado e a infecção ocorre, seguida da transferência gênica. 

Para demonstrar o potencial desta tecnologia no que se refere ao refinado controle sobre a liberação do transgene, os autores também realizaram experimentos com partículas contendo peptídeos reconhecidos por diferentes proteases. No exemplo indicado na figura abaixo, o vetor viral possui dois peptídeos diferentes e a infecção da célula alvo só acontece na presença de ambas as proteases ("azul" e "vermelha"). Infelizmente, a eficiência da terapia gênica utilizando estas partículas modificadas ainda é bastante inferior àquela obtida com o vetor-adeno-associado selvagem. Conforme discutido por Junghae Suh em um evento voltado a engenharia de tecidos, os segmentos petídicos remanescentes (após a clivagem) não estão impedindo a infecção das células alvo, mas parecem estar interferindo em alguma etapa intracelular subsequente. De qualquer modo, os resultados são muito interessantes e abrem caminho para novas formas de controle e direcionamento de terapia gênica utilizando vetores virais modificados.      

As figuras utilizadas neste post foram obtidas diretamente do site do Laboratório de Virologia Sintética (Rice University, Houston-TX) e do artigo original (Judd et al., 2014).

Na rota para uma ferramenta de predição de reatividade cruzada

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Em posts anteriores eu apresentei trabalhos desenvolvidos pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI/UFRGS), com foco na análise estrutural de complexos peptídeo:MHC (pMHC) e na predição de reatividade cruzada de linfócitos T (imunologia in silico, imunidade heteróloga). O grupo continua desenvolvendo esta linha de pesquisa, aprimorando uma metodologia para agrupar alvos virais com base na similaridade estrutural no contexto do MHC. Complexos pMHC estruturalmente semelhantes, apresentam maior probabilidade de ativar uma mesma população de linfócitos e, por outro lado, esta probabilidade é muito baixa para complexos muito diferentes. 

Em sua publicação mais recente (Mendes et. al, 2015), o grupo descreve uma versão aprimorada desta metodologia. Inicialmente, a estrutura dos alvos de interesse é predita, no contexto do MHC, utilizando uma metodologia baseada em ancoramento molecular (docking). Avaliando cristais de complexos TCRpMHC, o grupo identificou uma série de resíduos frequentemente envolvidos no reconhecimento dos alvos de linfócitos T, informação que foi utilizada para guiar a análise dos complexos modelados. Estes resíduos conservados, ou "regiões de interesse", foram utilizados para extrair dados estruturais, como área de acessibilidade ao solvente e potencial eletrostático na superfície molecular. Uma vez extraídos, estes dados foram utilizados em uma análise de agrupamento hierárquico (HCA, do inglês Hierarchical Cluster Analysis), revelando os complexos mais semelhantes. Outra inovação neste trabalho, diz respeito ao uso do pacote pvclust (linguagem R) para a geração do HCA. Além de realizar o agrupamento, este pacote fornece duas medidas de confiabilidade (bootstrap) para cada nó da árvore, permitindo a fácil identificação dos agrupamentos mais confiáveis. 

Neste estudo piloto, foram avaliados um conjunto de alvos do vírus da Dengue e um grupo de epitopos de HCV.  Este conjunto de HCV já havia sido abordado em trabalhos anteriores, permitindo a comparação direta com a nova metodologia. O resultados são coerentes com dados experimentais e oferecem uma forma inovadora de prospectar candidatos a reatividade cruzada (Figura 1), com implicações diretas para o desenvolvimento de vacinas. 

A etapa de modelagem dos complexos demanda maiores recursos computacionais e é realizada utilizando um protocolo próprio, mas o grupo está nas etapas finais de desenvolvimento de uma ferramenta automatizada e gratuita. O desafio seguinte diz respeito a aplicação desta técnica em larga escala, para modelagem e análise de redes de reatividade cruzada previamente descritas em trabalhos experimentais. Estes resultados serão utilizados para refinar a técnica de agrupamento baseado em estrutura e permitir o futuro desenvolvimento de uma ferramenta de predição de reatividade cruzada.

Figura 1. Agrupamento hierárquico de alvos virais no contexto do MHC humano HLA-A*02:01. Este conjunto inclui 8 alvos de Dengue e 28 alvos de HCV. No caso da Dengue, reatividade cruzada foi confirmada entre alvos da proteína NS4b. No caso do HCV, reatividade cruzada foi observada entre o tipo selvagem (G1.01) e variantes dos genótipos 4, 5 e 6 (ex.: G4.21, G5.22 e G6.28). De acordo com dados experimentais, o genótipo 1 incluía alguns indivíduos que não apresentavam reatividade cruzada com o tipo selvagem (ex.: G1.04). Modificado de Mendes et. al, 2015.

Infecções prévias com vírus heterólogos alteram a resposta individual à vacinação

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Figura 1.: Rede de reatividade cruzada envolvendo o alvo vacinal HCV-NS31073. Similaridade estrutural no contexto do MHC foi indicada como possível mecanismo para o desencadeamento de imunidade heteróloga, enquanto variabilidade individual e direcionalidade nas respostas observadas foram atribuídas ao histórico de infecções e o repertório privado de linfócitos T (Zhang e cols., 2015).

  A influência de infecções prévias sobre a resposta a novos desafios imunológicos não é nenhuma novidade para os imunologistas. O processo de imunização altera a composição do conjunto de linfócitos de memória de modo que algumas populações são expandidas, em detrimento de outras (Welsh & Selin, 2002). A imunidade heteróloga entre vírus parece ter um papel central neste contexto, sendo por sua vez moldada pelo repertório privado (individual) de linfócitos T CD8+ e por eventos de reatividade cruzada no reconhecimento de complexos peptideo:MHC (Welsh e cols., 2010). 

 Apesar de estes mecanismos serem reconhecidos, ainda nos surpreende quando respostas específicas para determinado alvo viral são encontradas em indivíduos que não tiveram exposição prévia a este patógeno. Pode uma simples gripe ou uma virose transmitida pelo beijo gerar algum nível de imunidade contra o Vírus da Hepatite C (HCV), por exemplo? Por mais incrível que pareça, eventos desta natureza já foram relatados em trabalhos prévios (Wedemeyer e cols., 2001), sendo provavelmente mais frequentes do que imaginávamos (Selin e cols., 2011). Em um trabalho recentemente publicado no Journal of Virology, Zhang e colaboradores (2015) descrevem a presença de linfócitos específicos para um alvo imunogênico de HCV (NS31073) em um terço dos indivíduos soronegativos para para este vírus, independente de fatores de risco para exposição a HCV. Análises ex vivo indicaram a presença tanto de células virgens quanto de células de memória, sugerindo que pelo menos uma parcela da resposta deve ser mediada por linfócitos originalmente expandidos na presença de vírus heterólogos (Figura 1).

  Uma análise de bioinformática estrutural (utilizando metodologia previamente descrita no SBlogI) sugeriu diferentes epitopos virais (derivados de EBV, CMV e Influenza) como possíveis alvos de reatividade cruzada, predições estas confirmadas em pelo menos uma parcela dos indivíduos. Cabe salientar que um destes alvos, EBV-LMP2329 (LLWTLVVLL), não apresenta qualquer similaridade de sequência com o epitopo HCV-NS31073 (CINGVCWTV), mas apresenta grande similaridade estrutural no contexto do MHC (Figura 2).

Figura 2.: Recorte da superfície dos complexos peptídeo:MHC, apresentando diferentes peptídeos virais no contexto da mesma molécula de MHC (HLA-A*02:01). Os domínios alfa-1 e alfa-2 da molécula de MHC, que flanqueiam o epitopo, são indicados. As cores indicam a distribuição do potencial eletrostático na superfície (vermelho = negativo, azul = positivo, branco = neutro). Neste conjunto, os alvos EBV-K1217 e EBV-BARF0356 apresentaram maior diferença em termos de potencial eletrostático (comparação utilizando agrupamento hierárquico). Alvos apresentando maior similaridade estrutural com o peptídeo vacinal de HCV (NS31073), considerando a superfície de interação com o TCR, foram selecionados para testes in vitro e respostas cruzada foram observadas em uma parcela dos indivíduos testados.

  O epitopo HCV-NS31073  foi previamente incluído na composição de uma vacina experimental anti-HCV, a qual foi utilizada por Zhang e colaboradores (2015) para imunizar indivíduos saudáveis. Acompanhando este grupo vacinado, os autores observaram resposta mais intensa e mais rápida nos indivíduos que apresentavam linfócitos específicos para HCV-NS31073 previamente a vacinação. Em conjunto, estes dados reforçam a hipótese de que a existência de células T "cross-reativas" previamente a imunização seja uma das variáveis responsáveis pela variabilidade individual à vacinação. A reatividade cruzada de células T parece ser mais comum do que previamente estimado, sendo possível até mesmo entre epitopos com baixa similaridade de sequência e podendo envolver diferentes alvos virais. Em conjunto com a variabilidade individual para a produção de linfócitos T (repertório privado), o histórico de infecções aumenta a variabilidade individual da resposta a vacinas e aponta para a necessidade de estratégias personalizadas. Outra questão importante se refere a "qualidade" desta resposta cruzada e a capacidade de estabelecer uma imunidade protetora, visto que respostas cruzadas fracas podem mediar infecção crônica e imunopatologia (Selin e cols., 2011, Wlodarczyk e cols., 2013).

  Embora vacinas personalizadas e avaliações em larga-escala do histórico pessoal de infecções virais ainda não sejam uma realidade, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas neste sentido. Uma publicação recente da revista Science descreve uma nova abordagem - rápida e barata - para detectar o histórico de infecções virais de um indivíduo (veja artigo do The Guardian). Metodologias como esta podem ter grande impacto no diagnóstico de doenças, na descoberta de novas associações entre infecções virais e a progressão de diferentes patologias humanas, bem como no desenvolvimento de vacinas mais seguras e mais eficientes. 

Big Data, Data Science, Statistical Learning & Data Visualization

     Vivemos na era do Big Data! Com a popularização da internet e vários outros avanços tecnológicos, estamos coletando uma quantidade de dados sem precedentes. Diariamente ao acessarmos nossas redes sociais ou nossos sites de compra, estamos fornecendo uma série de informações para os provedores destes serviços, referentes a nossa localização, rede de contatos, preferências de consumo, volume de gastos, etc. Uma pergunta que vem ocupando a mente de várias pessoas, sobretudo na computação e no marketing, é como usar estes dados para fazer predições e oferecer serviços personalizados. Na área da saúde, a dramática redução no custo do sequenciamento e de outras técnicas de alto rendimento (high throughput), bem como a exigência por estudos cada vez maiores e mais abrangentes, também elevou radicalmente o volume de dados produzido. E isto e só começo, com a chamada "internet das coisas" nossas roupas e acessórios passarão a coletar, processar e transmitir uma série de dados biométricos, os quais poderão ser utilizados para monitorar nossa saúde e realizar predições. Neste contexto, outro termo que vem ganhando espaço e o Data Science, definido por Hilary Manson como uma intersecção entre ciência da computação, estatística, engenharia e "hacking". Conhecimento especifico da área de interesse, como genética ou imunologia, completa o perfil do "data scientist". Certamente existe um pouco de moda e alguns exageros, mas conforme defende o Dr. Michael Franklin da Universidade da Califórnia (Berkeley), a Data Science esta se consolidando como uma área independente, atraindo investimentos, gerando oportunidades e direcionando as Universidades para a criação de currículos orientados a esta temática.

Hans Rosling: Dados sociais e demográficos de 200 países ao longo de 200 anos, 

apresentados em 4 minutos.

   Embora usualmente definido como um "problema", Michael Franklin argumenta que o principal aspecto de se trabalhar com Big Data são justamente as oportunidades únicas que "emergem" dos dados. Padrões que não poderiam ser observados utilizando-se amostras menores. Na área da epidemiologia, por exemplo, trabalhos recentes abordaram o uso de mecanismos de busca e redes sociais para fazer predições biomédicas. Em um exemplo, buscas na Wikipedia (Figura 1) foram utilizadas para predizer surtos de gripe com quase um mês de antecedência (Generous et. al, 2014). Em outro trabalho, postagens do Twitter foram utilizadas para medir os "sentimentos" das pessoas em relação a vacina da gripe (Influenza A, H1N1), sendo então capazes de predizer quais regiões seriam mais afetadas por casos de gripe (Salathé et. al, 2014).

Figura 1. Gráficos apresentando dados epidemiológicos oficiais e o modelo (nowcast) baseado no tráfego de artigos da Wikipedia, em um período de 3 anos (Generous et. al, 2014).

Mas os dados usualmente não falam sozinhos, é preciso saber extrair as informações desejadas. Dentre as ferramentas empregadas neste processo, os métodos de aprendizado estatístico (ou machine learning) tem se demonstrado particularmente interessantes. No campo da imunologia, por exemplo, estas ferramentas já estão sendo aplicadas para identificar alvos vacinais, descrever o mapa transcricional de linfócitos T CD8+ ao longo das etapas da resposta celular e inclusive para desvendar bases imunológicas no Alzheimer.  

    Um estudo de 2012 tentou caracterizar o perfil do "analista de dados", realizando entrevistas com 35 profissionais que realizavam esta função em diferentes áreas, incluindo finanças, pesquisa/saúde, redes sociais, marketing e varejo. Desconsiderando-se as limitações do estudo (tamanho amostral e distribuição geográfica), é interessante observar que estes profissionais foram ultimamente classificados em apenas três categorias: hacker, scripter e application user. Apesar da pressuposta similaridade quanto a área de atuação, os profissionais de cada grupo se diferenciavam bastante quanto ao perfil computacional e o tipo de tarefa desempenhada.  Enquanto os hackers apresentavam maior familiaridade com diferentes linguagens de programação e manipulação dos bancos de dados, os scripters conseguiam realizar análises estatísticas mais complexas (se restringindo ao uso de pacotes como R e Matlab). Os application users, por outro lado, se limitavam à análise de planilhas e ao uso de pacotes como SAS/JMP e SPSS, contando com o apoio de uma equipe de TI para fornecer os dados já no formato adequado. Além de refletir esta diversidade de profissionais e de perfis, em um mercado que claramente vive um período de expansão, o estudo também salientou a necessidade de novas ferramentas para visualização. A visualização é essencial não apenas na apresentação dos resultados, mas também no momento de "conhecer" os dados brutos. Ela facilita a interpretação do material de estudo e valoriza aspectos em que os humanos ainda superam as máquinas, como a capacidade de estabelecer relações e formular hipóteses. Existem testes estatísticos e modelos matemáticos para todos os gostos, mas em muitos casos eles se tornam inúteis caso não haja uma pergunta objetiva a ser respondida ou uma intuição sobre o comportamento dos dados. Neste contexto, o pesquisador sueco Hans Rosling (vídeo acima) tem sido um grande advogado do poder da estatística e da importância da visualização.

    Pra quem pretende ingressar na área, uma ótima pedida é o livro An introduction to Statistical Learning with applications in R. O livro apresenta uma linguagem acessível, mesmo para quem não tem base matemática ou computacional, além de uma série de exemplos e exercícios utilizando o pacote R. Uma das vantagens deste pacote é justamente a implementação de uma série de recursos para fácil manipulação e visualização dos dados.

Debate com Hilary Manson e outros especialistas sobre as perspectivas e as oportunidades do Big Data.

Post de Dinler Amaral Antunes

Complimentary Postdoctoral Research Associate at the Kavraki Lab.

Department of Computer Science - Rice University (Houston, TX). 

O que aprendemos com a modelagem e a dinâmica da enzima IDUA?

     A IDUA (alpha-L-Iduronidase) é um membro das glicosil hidrolases envolvida no catabolismo de glicosaminoglicanos (GAGs), principalmente sulfato de heparan e sulfato de dermatan. Mutações nesta enzima são responsáveis pela mucopolissacaridose do tipo I (MPS I), uma doença de depósito lisossômico com herança autossômica recessiva. Diferentes mutações podem gerar fenótipos mais graves ou mais brandos, o que gera grande interesse na determinação e no estudo da estrutura desta enzima. No entanto, a falta de moldes com alta identidade e dificuldades técnicas no processo de determinação experimental da enzima humana desafiaram bioinformatas e cristalógrafos por vários anos, até a recente publicação da primeira estrutura cristalográfica da IDUA (PDB: 4JXP, Figura 1). Até então, apenas dois modelos haviam sido publicados e o nosso grupo trabalhava na comparação de três novos modelos, obtidos com diferentes metodologias e ranqueados com base em diferentes parâmetros. Com a publicação do cristal foi possível comparar diretamente estes modelos com o dado experimental, além de verificar quais métodos de avaliação estavam nos direcionando para o modelo "mais correto".

Figura 1. Estrutura da enzima IDUA (a) obtida por cristalografia raios X (PDB: 4JXP), enfatizando o domínio catalítico (b). Figura publicada no artigo "Insights into mucopolysaccharidosis I from the structure and action of α-L-iduronidase", Nature Chemical Biology 9, 739–745 (2013). 

     Resumindo nossos resultados, confirmamos que erros no alinhamento entre a sequência molde e a sequencia alvo continuam sendo o principal gargalo para a modelagem por homologia, a despeito do software de modelagem utilizado. Também observamos que medidas estereoquímicas (como o diagrama de Ramachandran), se não forem combinadas com outras ferramentas, são incapazes de detectar alguns erros importantes dos modelo. Além de fazer uso combinado de ferramentas como Procheck, ModFOLD e Verify 3D, nós observamos que a análise da manutenção das estruturas secundárias durante simulações de dinâmica molecular (50 ns) fornece dados importantes sobre a qualidade dos modelos. Neste trabalho, o modelo que melhor se aproximou da estrutura cristalográfica (partindo de um molde com apenas 22% de homologia) foi justamente aquele que apresentou os melhores resultados no conjunto das avaliações realizadas, mas não necessariamente o primeiro do ranking em cada um das avaliações individuais.   

Até o dia 19 de Dezembro o artigo "Lessons from molecular modeling human α-l-iduronidase", Journal of Molecular Graphics and Modelling (2014), pode ser conferido gratuitamente utilizando-se este link. Depois desta data, será possível acessar o artigo no site da revista.

Post de Dinler Amaral Antunes

Complimentary Postdoctoral Research Associate at the Kavraki Lab.

Department of Computer Science - Rice University (Houston, TX).

Promessas da imunoinformática para uma nova geração de vacinas

     No último post eu comentei sobre o surgimento da imunoinformática e sobre o crescente uso de ferramentas computacionais para o desenvolvimento de vacinas, tendo mencionado um trabalho sobre a vacinologia reversa no século 21 [1]. Neste artigo, publicado em 2013, os autores discutem como as novas tecnologias ajudaram a aprimorar a proposta original da vacinologia reversa [2], a qual visa determinar o repertório antigênico de um dado patógeno à partir de sua sequência genômica. A proposta original foi planejada para levar rapidamente da sequência genômica de uma amostra patogênica a uma lista de candidatos vacinais, utilizando-se etapas de triagem virtual por bioinformática. O processo envolvia a testagem de um amplo painel de candidatos em modelos animais, de modo que apenas no final eram gerados dados epidemiológicos sobre os antígenos protetores. Nas aplicações mais recentes da vacinologia reversa, as etapas de bioinformática foram complementadas com diversas triagens experimentais, utilizando RNAseq, análises proteômicas, dados de micro-arranjo, citometria de fluxo, etc [1]. Os autores discutem ainda que o conhecimento acerca da epidemiologia dos candidatos vacinais, bem como sua regulação e a interação parasita-hospedeiro devem se tornar parte integral nos novos fluxogramas de triagem virtual.

     Em outra publicação de 2013, a equipe da empresa EpiVax, Inc. descreveu o JanusMatrix, uma ferramenta para a predição de reatividade cruzada em larga escala [3]. Baseada na análise de cristais de complexos TCRpMHC, foram identificados resíduos do epitopo (posições) que normalmente interagem com o TCR e resíduos que normalmente servem de âncora para o MHC. Assim, a ferramenta divide o epitopo de interesse em duas “faces”: a face que contata o MHC e a face que contata o TCR. Na prática isso significa mapear quais resíduos estão em cada face e utilizar este “padrão” como entrada para uma busca por identidade de sequência em larga escala. O algoritmo permite ainda certa variabilidade dos resíduos que compõe a face do MHC (aumentando sua sensibilidade), desde que não prejudiquem a ligação com o mesmo. A ferramenta foi inicialmente utilizada para mapear a ocorrência de potenciais alvos de reatividade cruzada em sequências proteicas obtidas do genoma humano, assim como do microbioma e do genoma de vírus e bactérias patogênicas (Figura 1).

Figura 1. Redes de reatividade cruzada para epitopos de linfócitos T regulatórios (A) e efetores (B). Sequências proteicas derivadas do genoma humano (esquerda) do microbioma humano (centro) ou de genomas virais e bacterianos (direita) foram triadas utilizando-se a ferramenta JanusMatrix. Os losangos verdes indicam os peptídeos utilizados como entrada (fonte), quadrados cinza são epitopos (9mers) derivados do epitopo fonte, triângulos azuis indicam epitopos que são 100% idênticos ao epitopo fonte no que se refere ao padrão da "face do TCR" (e que também são apresentados por HLA), enquanto círculos roxos indicam proteínas contendo possíveis alvos de reatividade cruzada (de acordo com a "face do TCR").

     Os autores salientam as possíveis aplicações da ferramenta JanusMatrix, mas ponderam que esta análise em larga escala esta voltada a aspectos populacionais, não sendo precisa no que se refere a respostas de indivíduos ou o contexto de MHCs específicos. Em um trabalho mais recente [4], o grupo coordenado pela pesquisadora Anne S. De Groot salientam a dificuldade de se desenvolver vacinas para doenças infecciosas emergentes e doenças tropicais negligenciadas, mesmo após a publicação de seus genomas. Alguns destes patógenos possuem ciclos de vida com diversos estágios e uma variedade de vetores, o que aumenta a complexidade do processo de desenvolvimento de vacinas. Neste trabalho os autores apresentam algumas implementações de imunoinformática utilizando o JanusMatrix para realizar uma busca sistemática por alvos imunodominantes em sequencias genômicas recém determinadas, com aplicações no desenvolvimento de vacinas. Seguindo esta tendência, outros algoritmos e fluxogramas combinando imunoinformática e testes in vitro deverão ser publicados nos próximos anos na tentativa de superar alguns dos grandes desafios atuais da vacinologia.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Doutor em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

1. Donati C, Rappuoli R (2013) Reverse vaccinology in the 21st century: improvements over the original design. Ann N Y Acad Sci 1285: 115-132

2. Rappuoli R (2000) Reverse vaccinology. Curr Opin Microbiol 3: 445-450.

3. Moise L, Gutierrez AH, Bailey-Kellogg C, Terry F, Leng Q, Abdel Hady KM, VerBerkmoes NC, Sztein MB, Losikoff PT, Martin WD, Rothman AL, De Groot AS. (2013) The two-faced T cell epitope: examining the host-microbe interface with JanusMatrix. Hum Vaccin Immunother. 9(7):1577-86.

4. Terry FE, Moise L, Martin RF, Torres M, Pilotte N, Williams SA, De Groot AS. Time for T? (2014) Immunoinformatics addresses vaccine design for neglected tropical and emerging infectious diseases. Expert Rev Vaccines. 5:1-15.

Genética e Bioinformática se encontram nas fronteiras da Imunologia

A elucidação dos mecanismos envolvidos na geração da variabilidade de anticorpos e TCRs representa uma das maiores conquistas da imunologia. Enquanto a variabilidade dos MHCs é dada pelo elevado polimorfismo na região cromossômica que codifica estas moléculas (6p21.3, em humanos), a variabilidade de TCRs e imunoglobulinas (IGs) é dada por um complexo mecanismo genético envolvendo a recombinação de segmentos variáveis identificados pelas letras V (variable), D (diversity) e J (joining). Estes mecanismos foram esclarecidos ao logo das décadas de 80 e 90 [1,2,3,4], um período de ouro para a imunogenética e que coincide com o primeiro momento de crescimento no número de publicações em bioinformática (Figura 1).

                                                                                                               

Figura 1. Número de publicações no PubMed com os termos "immunogenetics" e "bioinformatics" entre os anos de 1965 e 1998. O pico observado para as publicações em imunogenética com ápice em 1971 se refere a elucidação do papel do antígeno H no sistema ABO [5,6,7], enquanto a aparente queda nas publicações a partir de 1975 pode refletir o maior enfoque dado as avaliações funcionais (após a descrição dos anticorpos monoclonais). O terceiro pico, em 1981, se refere as publicações sobre o sistema V-D-J [1,2]. As publicações em bioinformática continuaram crescendo até estabilizar entre 2012 e 2013 (anos nos quais foram registradas 16.302 e 16.009 publicações com este termo, respectivamente).

Neste período efervescente para a imunogenética e a bioinformática, foi criado na França o IMGT (the international ImMunoGeneTics information system)[8,9]. Segundo uma recente publicação da revista Frontiers in Immunology [9], a criação deste banco - especializado em genes e proteínas de interesse da imunologia - marcaria o nascimento da "Imunoinformática". A proposta do IMGT se diferencia de outros repositórios de dados biológicos justamente por sua preocupação em fornecer o tratamento adequado da informação envolvida na variabilidade de IGs, TCRs e MHCs. Ele foi desenvolvido sobre um conjunto de axiomas e conceitos (IMGT-ONTOLOGY), para permitir a correlação entre sequências gênicas, sequências proteicas e as estruturas destas moléculas complexas (Figura 2).

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Figura 2. Acima, estrutura de uma imunoglobulina (IG), molécula central na resposta imunológica humoral. A direita, representação de um complexo TCR/peptídeo:MHC, elemento chave na montagem das respostas imunológicas celulares. Figuras publicadas por Marie-Paule Lefranc (2014) [9], na revista Frontiers in Immunology.

Atualmente o IMGT compreende um total de sete bancos, com mais de 15.000 páginas de recursos online e 17 ferramentas, fornecendo ainda um sistema para a análise de dados genômicos e de expressão para IGs e TCRs. O IMGT fornece ferramentas como IMGT/Collier-de-Perles tool, o qual permite criar representações didáticas das moléculas de interesse do usuário, seguindo o padrão de numeração e nomenclatura desenvolvido pelo IMGT. Esta é uma alternativa muito interessante para o estudo dos diferentes polimorfismos nas moléculas de MHC. Outra ferramenta de destaque é o IMGT/V-QUEST, que permite a análise de sequências nucleotídicas dos domínios variáveis de IGs e TCRs, sendo capaz de identificar os genes V, D e J nas sequências rearranjadas das moléculas estudadas pelo usuário. Além disso, no caso de IGs, a ferramenta consegue identificar as mutações nucleotídicas e as consequentes trocas de aminoácidos oriundas do processo de hipermutação somática, através da comparação com dados de referência do próprio IMGT/V-QUEST. 

Figura 3. Número de publicações no PubMed com os termos "immunoinformatics","reverse vaccinology" e "computational vaccinology", entre os anos de 1998 e 2013.

Sendo um tema central para a imunologia, a vacinologia sempre esteve presente nas discussões em imunoinformática. O termo "vacinologia reversa" foi cunhado em 2000 pelo italiano Rino Rappuoli [10], para se referir a um processo de desenvolvimento de vacinas que se iniciava pela análise de sequências genômicas in silico, seguido pela identificação de alvos e posterior expressão de proteínas recombinantes para testes in vivo. Esta estratégia continua sendo discutida e aplicada, acumulando uma série de resultados interessantes na imunização contra vírus e bactérias [11,12,13]. Mais recentemente começou a se popularizar o termo "vacinologia computacional", que também tem sido discutida como uma alternativa na pesquisa em câncer [14,15]. Independentemente do termo mais utilizado (ou mais adequado), o fato é que o uso de ferramentas computacionais para o desenvolvimento de vacinas é uma realidade que vem ganhando força (Figura 3), sobretudo graças ao crescimento da comunidade de bioinformatas interessados em imunologia e a rápida evolução dos recursos computacionais.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Nota: 
Agradeço ao professor José Artur Bogo Chies (Laboratório de Imunogenética/UFRGS) pelo suporte na pesquisa sobre Imunogenética.

Referências:

1. Kurosawa Y, von Boehmer H, Haas W, Sakano H, Trauneker A, et al. (1981) Identification of D segments of immunoglobulin heavy-chain genes and their rearrangement in T lymphocytes. Nature 290: 565-570.

2. Maki R, Roeder W, Traunecker A, Sidman C, Wabl M, et al. (1981) The role of DNA rearrangement and alternative RNA processing in the expression of immunoglobulin delta genes. Cell 24: 353-365.

3. Schatz DG, Oettinger MA, Schlissel MS (1992) V(D)J recombination: molecular biology and regulation. Annu Rev Immunol 10: 359-383.

4. Fanning L, Bertrand FE, Steinberg C, Wu GE (1998) Molecular mechanisms involved in receptor editing at the Ig heavy chain locus. Int Immunol 10: 241-246.

5. Sanger R, Race RR (1971) Immunogenetics of certain antigens of the red cell membrane. Nouv Rev Fr Hematol 11: 878-884.
6. Salmon C (1971) [Immunogenetics of ABH antigens]. Nouv Rev Fr Hematol 11: 850-862.
7. Petrov RV (1971) [Current problems of immunogenetics]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 48: 7-12.
8. Giudicelli V, Chaume D, Bodmer J, Muller W, Busin C, et al. (1997) IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res 25: 206-211.
9. Lefranc MP (2014) Immunoglobulin and T Cell Receptor Genes: IMGT((R)) and the Birth and Rise of Immunoinformatics. Front Immunol 5: 22.
10. Rappuoli R (2000) Reverse vaccinology. Curr Opin Microbiol 3: 445-450.
11. Vivona S, Gardy JL, Ramachandran S, Brinkman FS, Raghava GP, et al. (2008) Computer-aided biotechnology: from immuno-informatics to reverse vaccinology. Trends Biotechnol 26: 190-200.
12. Donati C, Rappuoli R (2013) Reverse vaccinology in the 21st century: improvements over the original design. Ann N Y Acad Sci 1285: 115-132.
13. Delany I, Rappuoli R, Seib KL (2013) Vaccines, reverse vaccinology, and bacterial pathogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med 3: a012476.
14. Pappalardo F, Chiacchio F, Motta S (2013) Cancer vaccines: state of the art of the computational modeling approaches. Biomed Res Int 2013: 106407.
15. Petrizzo A, Tagliamonte M, Tornesello M, Buonaguro FM, Buonaguro L (2014) Systems vaccinology for cancer vaccine development. Expert Rev Vaccines 13: 711-719.