Predição da estabilidade dos complexos peptídeo:MHC e o "desprendimento" do ligante

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA

Figura 1. Ilustração de Eric Reits para representar a rota 
de apresentação de peptídeos endógenos. Uma amostra 
das proteínas intracelulares é processada e apresentada
na superfície celular no contexto do MHC-I, permitindo seu
 reconhecimento pelos linfócitos T (Yewdell et al., 2003).

    A apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular representa uma rota central para a resposta imunológica adaptativa. Este mecanismo, presente em praticamente todas as células nucleadas do organismo, possibilita que linfócitos T circulantes (CD8+) "fiscalizem" o conteúdo intracelular destas células apresentadoras, permitindo a detecção de infecções virais e tumores. Esta rota pode ser explicada de maneira simples, sendo visivelmente uma espécie de "controle de qualidade" do conteúdo intracelular (Figura 1). Os detalhes moleculares desta rota, no entanto, são bastante complexos e variáveis. Por exemplo, se tentarmos entender quais são os requisitos responsáveis pela capacidade de um peptídeo de desencadear a ativação de um linfócito, perceberemos o envolvimento de múltiplas variáveis relacionadas a diferentes etapas deste processo. Em primeiro lugar, o peptídeo precisa ser capaz de "sobreviver" ao processamento, uma vez que nem todos os possíveis peptídeos contidos em uma dada proteína são apresentados na superfície (Yewdell et al., 2003). Um ponto importante nesta etapa de processamento diz respeito a capacidade de ligação dos peptídeos gerados às moléculas de MHC de classe I (sigla em inglês para Complexo Principal de Histocompatibilidade). Hoje temos acesso a uma ampla coleção de dados sobre ligação de peptídeos a moléculas de MHC e é possível inclusive predizer a afinidade de ligação do complexo considerando-se as sequências das moléculas envolvidas (Backert & Kohlbacher, 2015; Karosiene et al., 2012). No final desta rota, o conjunto peptídeo:MHC (pMHC) poderá interagir com linfócitos circulantes e o desfecho da resposta dependerá de uma série de fatores envolvidos na afinidade da interação entre o pMHC e o receptor de linfócito T (ou TCR, na sigla em inglês). Em um capítulo de livro publicado em 2012 nós utilizamos o termo reatividade para nos referirmos a esta etapa final e os fatores envolvidos na ativação dos linfócitos T citotóxicos. No mesmo capítulo, nós discutimos a importância de um "nível de seleção" intermediário entre o processamento e a reatividade, relativo a estabilidade do complexo pMHC.
    Embora intuitivamente possamos imaginar que a estabilidade de um dado pMHC será um reflexo da afinidade de ligação do complexo, de modo que apenas pMHCs estáveis serão formados no retículo endoplasmático e consequentemente apresentados na superfície, esta relação nem sempre é observada. Na verdade, os dados sugerem que a estabilidade do pMHC é inclusive um melhor preditor da imunogenicidade do peptídeo do que a própria afinidade de ligação (van der Burg at al., 1996; Harndahl et al., 2012; Jorgensen et al. 2014). Embora os já conhecidos "resíduos âncoras" sejam primariamente envolvidos na afinidade do complexo, as cadeias laterais de outros resíduos secundários podem influenciar positivamente ou negativamente na manutenção do modo de ligação mais favorável, o que pode levar a instabilidade do complexo (Jorgensen et al. 2014). Isso acaba tendo impacto direto na possível estimulação de linfócitos, sobretudo considerando que uma diversidade de peptídeos está sendo apresentada ao mesmo tempo e que estes diferentes complexos pMHC estão competindo pela interação com o TCR; complexos mais numerosos e mais estáveis tem maior chance de serem reconhecidos (dependendo também dos fatores envolvidos na reatividade).

Figura 2. Visualização dos dados obtidos de uma dinâmica
 molecular de um complexo pMHC não estável. Os cones
verdes indicam a direção e a intensidade das forças
observadas em determinados resíduos. Neste exemplo,
elas indicam uma forte tendência de desprendimento
da porção C-terminal do ligante. Estes dados diferem
daqueles observados para um ligante controle. Modificado
 da Tese de Doutorado de Maurício M. Rigo (2015). 

    O servidor netMHCstab utiliza redes neurais para predizer a estabilidade de um dado complexo pMHC com base na análise de sequencias, tendo apresentado resultados promissores na identificação de epitopos de linfócito T quando combinado a um método consenso para predição de afinidade de ligação ao MHC (Jorgensen et al. 2014). No entanto, estes métodos baseados em análise de sequência são muito dependentes da qualidade e do volume de dados utilizado para treinar as predições (Wang et al., 2014). Esta restrição muitas vezes impede a generalização das predições para outros alelos de MHC ou outros tamanhos de ligantes, visto que os dados experimentais ainda são limitados para a maioria dos alelos (considerando-se apenas os MHCs de classe I clássicos, são mais de 10 mil alelos descritos em humanos). Métodos estruturais tem potencial para permitirem uma maior generalização das predições, especialmente considerando-se uma característica dinâmica como estabilidade. Em tese, tendo-se uma estrutura inicial do complexo é possível calcular as forças envolvidas na interação e simular o comportamento do complexo em solução. Durante seu trabalho de Doutorado desenvolvido na UFRGS, meu colega Maurício Menegatti Rigo utilizou métodos de docking e dinâmica molecular para estudar a estabilidade de ligantes na fenda do MHC. Utilizando dados obtidos de simulações considerando a real estrutura das moléculas envolvidas (full-atom MD) foi possível observar claros sinais de instabilidade em peptídeos mutados (Figura 2), além de identificar algumas interações que parecem ser mais importantes para a manutenção do modo de ligação.
    A dinâmica molecular é a ferramenta de bioinformática estrutural com a maior precisão em termos da correta descrição das forças envolvidas e das trajetórias moleculares preditas para um dado sistema. No entanto, esta precisão acarreta um elevado custo computacional que em muitos casos inviabiliza a análise de sistemas muito grandes, ou a observação de eventos que ocorrem em escalas de tempo superiores a centenas de microssegundos. O trabalho descrito acima corrobora o potencial preditivo da dinâmica molecular quanto a instabilidade do complexo, mas nestas simulações curtas (20 ns) não é possível observar o completo "desprendimento" do ligante. Na verdade, um trabalho recente demonstrou que o desprendimento completo pode não ser observado mesmo em uma dinâmica molecular de 1000 ns (1 µs), a mais longa simulação de um complexo pMHC já publicada (full-atom MD) (Knapp et al., 2015). Para conseguir observar este evento em nível molecular, os autores implementaram uma estratégia alternativa. Em primeiro lugar, ao invés de considerar a descrição atômica das moléculas envolvidas, eles utilizaram uma representação simplificada dos resíduos (coarse-grained 3-point model). Em segundo lugar, eles utilizaram um método de segmentação hierárquica da proteína para restringir a flexibilidade de grupos de resíduos, o que também melhora a performance (reduz graus de liberdade) e previne a perda do correto enovelamento da proteína (unfolding). Os movimentos neste sistema foram então explorados através do método de Monte Carlo. Finalmente, eles realizaram repetidas etapas de simulated annealing para permitir uma rápida exploração do espaço conformacional sem ficar restrito a mínimos locais de energia. Esta abordagem permitiu observar o completo desprendimento da fenda em um tempo computacionalmente viável (Figura 3) e foi capaz de discriminar entre ligantes e não ligantes (AROC = 0,85). Esta é a primeira vez em que são descritas conformações intermediárias do ligante durante o processo de desprendimento do MHC, possibilitando novos insights e revelando outros detalhes moleculares importantes para o desencadeamento de uma resposta imunológica celular. A capacidade de predizer dados experimentais corrobora a hipótese de que as simplificações realizadas não prejudicaram a correta descrição das moléculas simuladas, mas futuros experimentos serão necessários para determinar a real acurácia e a potencial generalização dos resultados observados.

Figura 3. Simulação do processo de desprendimento de um peptídeo da fenda do MHC utilizando (A) uma nova metodologia baseada em coarse-grained Monte Carlo e simulated annealing (HNMMC) ou (B) dinâmica molecular. O peptídeo utilizado (AAAKTPVIV) foi previamente descrito como não ligante de HLA-A*0201, alelo utilizado nestes experimentos. A técnica HNMMC foi capaz de descrever um completo desprendimento da fenda, em um tempo muito inferior ao da dinâmica molecular (C). Figura publicada em Knapp et al., 2015.

Na rota para uma ferramenta de predição de reatividade cruzada

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Em posts anteriores eu apresentei trabalhos desenvolvidos pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI/UFRGS), com foco na análise estrutural de complexos peptídeo:MHC (pMHC) e na predição de reatividade cruzada de linfócitos T (imunologia in silico, imunidade heteróloga). O grupo continua desenvolvendo esta linha de pesquisa, aprimorando uma metodologia para agrupar alvos virais com base na similaridade estrutural no contexto do MHC. Complexos pMHC estruturalmente semelhantes, apresentam maior probabilidade de ativar uma mesma população de linfócitos e, por outro lado, esta probabilidade é muito baixa para complexos muito diferentes. 

Em sua publicação mais recente (Mendes et. al, 2015), o grupo descreve uma versão aprimorada desta metodologia. Inicialmente, a estrutura dos alvos de interesse é predita, no contexto do MHC, utilizando uma metodologia baseada em ancoramento molecular (docking). Avaliando cristais de complexos TCRpMHC, o grupo identificou uma série de resíduos frequentemente envolvidos no reconhecimento dos alvos de linfócitos T, informação que foi utilizada para guiar a análise dos complexos modelados. Estes resíduos conservados, ou "regiões de interesse", foram utilizados para extrair dados estruturais, como área de acessibilidade ao solvente e potencial eletrostático na superfície molecular. Uma vez extraídos, estes dados foram utilizados em uma análise de agrupamento hierárquico (HCA, do inglês Hierarchical Cluster Analysis), revelando os complexos mais semelhantes. Outra inovação neste trabalho, diz respeito ao uso do pacote pvclust (linguagem R) para a geração do HCA. Além de realizar o agrupamento, este pacote fornece duas medidas de confiabilidade (bootstrap) para cada nó da árvore, permitindo a fácil identificação dos agrupamentos mais confiáveis. 

Neste estudo piloto, foram avaliados um conjunto de alvos do vírus da Dengue e um grupo de epitopos de HCV.  Este conjunto de HCV já havia sido abordado em trabalhos anteriores, permitindo a comparação direta com a nova metodologia. O resultados são coerentes com dados experimentais e oferecem uma forma inovadora de prospectar candidatos a reatividade cruzada (Figura 1), com implicações diretas para o desenvolvimento de vacinas. 

A etapa de modelagem dos complexos demanda maiores recursos computacionais e é realizada utilizando um protocolo próprio, mas o grupo está nas etapas finais de desenvolvimento de uma ferramenta automatizada e gratuita. O desafio seguinte diz respeito a aplicação desta técnica em larga escala, para modelagem e análise de redes de reatividade cruzada previamente descritas em trabalhos experimentais. Estes resultados serão utilizados para refinar a técnica de agrupamento baseado em estrutura e permitir o futuro desenvolvimento de uma ferramenta de predição de reatividade cruzada.

Figura 1. Agrupamento hierárquico de alvos virais no contexto do MHC humano HLA-A*02:01. Este conjunto inclui 8 alvos de Dengue e 28 alvos de HCV. No caso da Dengue, reatividade cruzada foi confirmada entre alvos da proteína NS4b. No caso do HCV, reatividade cruzada foi observada entre o tipo selvagem (G1.01) e variantes dos genótipos 4, 5 e 6 (ex.: G4.21, G5.22 e G6.28). De acordo com dados experimentais, o genótipo 1 incluía alguns indivíduos que não apresentavam reatividade cruzada com o tipo selvagem (ex.: G1.04). Modificado de Mendes et. al, 2015.

Infecções prévias com vírus heterólogos alteram a resposta individual à vacinação

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Figura 1.: Rede de reatividade cruzada envolvendo o alvo vacinal HCV-NS31073. Similaridade estrutural no contexto do MHC foi indicada como possível mecanismo para o desencadeamento de imunidade heteróloga, enquanto variabilidade individual e direcionalidade nas respostas observadas foram atribuídas ao histórico de infecções e o repertório privado de linfócitos T (Zhang e cols., 2015).

  A influência de infecções prévias sobre a resposta a novos desafios imunológicos não é nenhuma novidade para os imunologistas. O processo de imunização altera a composição do conjunto de linfócitos de memória de modo que algumas populações são expandidas, em detrimento de outras (Welsh & Selin, 2002). A imunidade heteróloga entre vírus parece ter um papel central neste contexto, sendo por sua vez moldada pelo repertório privado (individual) de linfócitos T CD8+ e por eventos de reatividade cruzada no reconhecimento de complexos peptideo:MHC (Welsh e cols., 2010). 

 Apesar de estes mecanismos serem reconhecidos, ainda nos surpreende quando respostas específicas para determinado alvo viral são encontradas em indivíduos que não tiveram exposição prévia a este patógeno. Pode uma simples gripe ou uma virose transmitida pelo beijo gerar algum nível de imunidade contra o Vírus da Hepatite C (HCV), por exemplo? Por mais incrível que pareça, eventos desta natureza já foram relatados em trabalhos prévios (Wedemeyer e cols., 2001), sendo provavelmente mais frequentes do que imaginávamos (Selin e cols., 2011). Em um trabalho recentemente publicado no Journal of Virology, Zhang e colaboradores (2015) descrevem a presença de linfócitos específicos para um alvo imunogênico de HCV (NS31073) em um terço dos indivíduos soronegativos para para este vírus, independente de fatores de risco para exposição a HCV. Análises ex vivo indicaram a presença tanto de células virgens quanto de células de memória, sugerindo que pelo menos uma parcela da resposta deve ser mediada por linfócitos originalmente expandidos na presença de vírus heterólogos (Figura 1).

  Uma análise de bioinformática estrutural (utilizando metodologia previamente descrita no SBlogI) sugeriu diferentes epitopos virais (derivados de EBV, CMV e Influenza) como possíveis alvos de reatividade cruzada, predições estas confirmadas em pelo menos uma parcela dos indivíduos. Cabe salientar que um destes alvos, EBV-LMP2329 (LLWTLVVLL), não apresenta qualquer similaridade de sequência com o epitopo HCV-NS31073 (CINGVCWTV), mas apresenta grande similaridade estrutural no contexto do MHC (Figura 2).

Figura 2.: Recorte da superfície dos complexos peptídeo:MHC, apresentando diferentes peptídeos virais no contexto da mesma molécula de MHC (HLA-A*02:01). Os domínios alfa-1 e alfa-2 da molécula de MHC, que flanqueiam o epitopo, são indicados. As cores indicam a distribuição do potencial eletrostático na superfície (vermelho = negativo, azul = positivo, branco = neutro). Neste conjunto, os alvos EBV-K1217 e EBV-BARF0356 apresentaram maior diferença em termos de potencial eletrostático (comparação utilizando agrupamento hierárquico). Alvos apresentando maior similaridade estrutural com o peptídeo vacinal de HCV (NS31073), considerando a superfície de interação com o TCR, foram selecionados para testes in vitro e respostas cruzada foram observadas em uma parcela dos indivíduos testados.

  O epitopo HCV-NS31073  foi previamente incluído na composição de uma vacina experimental anti-HCV, a qual foi utilizada por Zhang e colaboradores (2015) para imunizar indivíduos saudáveis. Acompanhando este grupo vacinado, os autores observaram resposta mais intensa e mais rápida nos indivíduos que apresentavam linfócitos específicos para HCV-NS31073 previamente a vacinação. Em conjunto, estes dados reforçam a hipótese de que a existência de células T "cross-reativas" previamente a imunização seja uma das variáveis responsáveis pela variabilidade individual à vacinação. A reatividade cruzada de células T parece ser mais comum do que previamente estimado, sendo possível até mesmo entre epitopos com baixa similaridade de sequência e podendo envolver diferentes alvos virais. Em conjunto com a variabilidade individual para a produção de linfócitos T (repertório privado), o histórico de infecções aumenta a variabilidade individual da resposta a vacinas e aponta para a necessidade de estratégias personalizadas. Outra questão importante se refere a "qualidade" desta resposta cruzada e a capacidade de estabelecer uma imunidade protetora, visto que respostas cruzadas fracas podem mediar infecção crônica e imunopatologia (Selin e cols., 2011, Wlodarczyk e cols., 2013).

  Embora vacinas personalizadas e avaliações em larga-escala do histórico pessoal de infecções virais ainda não sejam uma realidade, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas neste sentido. Uma publicação recente da revista Science descreve uma nova abordagem - rápida e barata - para detectar o histórico de infecções virais de um indivíduo (veja artigo do The Guardian). Metodologias como esta podem ter grande impacto no diagnóstico de doenças, na descoberta de novas associações entre infecções virais e a progressão de diferentes patologias humanas, bem como no desenvolvimento de vacinas mais seguras e mais eficientes. 

Promessas da imunoinformática para uma nova geração de vacinas

     No último post eu comentei sobre o surgimento da imunoinformática e sobre o crescente uso de ferramentas computacionais para o desenvolvimento de vacinas, tendo mencionado um trabalho sobre a vacinologia reversa no século 21 [1]. Neste artigo, publicado em 2013, os autores discutem como as novas tecnologias ajudaram a aprimorar a proposta original da vacinologia reversa [2], a qual visa determinar o repertório antigênico de um dado patógeno à partir de sua sequência genômica. A proposta original foi planejada para levar rapidamente da sequência genômica de uma amostra patogênica a uma lista de candidatos vacinais, utilizando-se etapas de triagem virtual por bioinformática. O processo envolvia a testagem de um amplo painel de candidatos em modelos animais, de modo que apenas no final eram gerados dados epidemiológicos sobre os antígenos protetores. Nas aplicações mais recentes da vacinologia reversa, as etapas de bioinformática foram complementadas com diversas triagens experimentais, utilizando RNAseq, análises proteômicas, dados de micro-arranjo, citometria de fluxo, etc [1]. Os autores discutem ainda que o conhecimento acerca da epidemiologia dos candidatos vacinais, bem como sua regulação e a interação parasita-hospedeiro devem se tornar parte integral nos novos fluxogramas de triagem virtual.

     Em outra publicação de 2013, a equipe da empresa EpiVax, Inc. descreveu o JanusMatrix, uma ferramenta para a predição de reatividade cruzada em larga escala [3]. Baseada na análise de cristais de complexos TCRpMHC, foram identificados resíduos do epitopo (posições) que normalmente interagem com o TCR e resíduos que normalmente servem de âncora para o MHC. Assim, a ferramenta divide o epitopo de interesse em duas “faces”: a face que contata o MHC e a face que contata o TCR. Na prática isso significa mapear quais resíduos estão em cada face e utilizar este “padrão” como entrada para uma busca por identidade de sequência em larga escala. O algoritmo permite ainda certa variabilidade dos resíduos que compõe a face do MHC (aumentando sua sensibilidade), desde que não prejudiquem a ligação com o mesmo. A ferramenta foi inicialmente utilizada para mapear a ocorrência de potenciais alvos de reatividade cruzada em sequências proteicas obtidas do genoma humano, assim como do microbioma e do genoma de vírus e bactérias patogênicas (Figura 1).

Figura 1. Redes de reatividade cruzada para epitopos de linfócitos T regulatórios (A) e efetores (B). Sequências proteicas derivadas do genoma humano (esquerda) do microbioma humano (centro) ou de genomas virais e bacterianos (direita) foram triadas utilizando-se a ferramenta JanusMatrix. Os losangos verdes indicam os peptídeos utilizados como entrada (fonte), quadrados cinza são epitopos (9mers) derivados do epitopo fonte, triângulos azuis indicam epitopos que são 100% idênticos ao epitopo fonte no que se refere ao padrão da "face do TCR" (e que também são apresentados por HLA), enquanto círculos roxos indicam proteínas contendo possíveis alvos de reatividade cruzada (de acordo com a "face do TCR").

     Os autores salientam as possíveis aplicações da ferramenta JanusMatrix, mas ponderam que esta análise em larga escala esta voltada a aspectos populacionais, não sendo precisa no que se refere a respostas de indivíduos ou o contexto de MHCs específicos. Em um trabalho mais recente [4], o grupo coordenado pela pesquisadora Anne S. De Groot salientam a dificuldade de se desenvolver vacinas para doenças infecciosas emergentes e doenças tropicais negligenciadas, mesmo após a publicação de seus genomas. Alguns destes patógenos possuem ciclos de vida com diversos estágios e uma variedade de vetores, o que aumenta a complexidade do processo de desenvolvimento de vacinas. Neste trabalho os autores apresentam algumas implementações de imunoinformática utilizando o JanusMatrix para realizar uma busca sistemática por alvos imunodominantes em sequencias genômicas recém determinadas, com aplicações no desenvolvimento de vacinas. Seguindo esta tendência, outros algoritmos e fluxogramas combinando imunoinformática e testes in vitro deverão ser publicados nos próximos anos na tentativa de superar alguns dos grandes desafios atuais da vacinologia.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Doutor em Ciências pelo Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

1. Donati C, Rappuoli R (2013) Reverse vaccinology in the 21st century: improvements over the original design. Ann N Y Acad Sci 1285: 115-132

2. Rappuoli R (2000) Reverse vaccinology. Curr Opin Microbiol 3: 445-450.

3. Moise L, Gutierrez AH, Bailey-Kellogg C, Terry F, Leng Q, Abdel Hady KM, VerBerkmoes NC, Sztein MB, Losikoff PT, Martin WD, Rothman AL, De Groot AS. (2013) The two-faced T cell epitope: examining the host-microbe interface with JanusMatrix. Hum Vaccin Immunother. 9(7):1577-86.

4. Terry FE, Moise L, Martin RF, Torres M, Pilotte N, Williams SA, De Groot AS. Time for T? (2014) Immunoinformatics addresses vaccine design for neglected tropical and emerging infectious diseases. Expert Rev Vaccines. 5:1-15.

Genética e Bioinformática se encontram nas fronteiras da Imunologia

A elucidação dos mecanismos envolvidos na geração da variabilidade de anticorpos e TCRs representa uma das maiores conquistas da imunologia. Enquanto a variabilidade dos MHCs é dada pelo elevado polimorfismo na região cromossômica que codifica estas moléculas (6p21.3, em humanos), a variabilidade de TCRs e imunoglobulinas (IGs) é dada por um complexo mecanismo genético envolvendo a recombinação de segmentos variáveis identificados pelas letras V (variable), D (diversity) e J (joining). Estes mecanismos foram esclarecidos ao logo das décadas de 80 e 90 [1,2,3,4], um período de ouro para a imunogenética e que coincide com o primeiro momento de crescimento no número de publicações em bioinformática (Figura 1).

                                                                                                               

Figura 1. Número de publicações no PubMed com os termos "immunogenetics" e "bioinformatics" entre os anos de 1965 e 1998. O pico observado para as publicações em imunogenética com ápice em 1971 se refere a elucidação do papel do antígeno H no sistema ABO [5,6,7], enquanto a aparente queda nas publicações a partir de 1975 pode refletir o maior enfoque dado as avaliações funcionais (após a descrição dos anticorpos monoclonais). O terceiro pico, em 1981, se refere as publicações sobre o sistema V-D-J [1,2]. As publicações em bioinformática continuaram crescendo até estabilizar entre 2012 e 2013 (anos nos quais foram registradas 16.302 e 16.009 publicações com este termo, respectivamente).

Neste período efervescente para a imunogenética e a bioinformática, foi criado na França o IMGT (the international ImMunoGeneTics information system)[8,9]. Segundo uma recente publicação da revista Frontiers in Immunology [9], a criação deste banco - especializado em genes e proteínas de interesse da imunologia - marcaria o nascimento da "Imunoinformática". A proposta do IMGT se diferencia de outros repositórios de dados biológicos justamente por sua preocupação em fornecer o tratamento adequado da informação envolvida na variabilidade de IGs, TCRs e MHCs. Ele foi desenvolvido sobre um conjunto de axiomas e conceitos (IMGT-ONTOLOGY), para permitir a correlação entre sequências gênicas, sequências proteicas e as estruturas destas moléculas complexas (Figura 2).

              .

Figura 2. Acima, estrutura de uma imunoglobulina (IG), molécula central na resposta imunológica humoral. A direita, representação de um complexo TCR/peptídeo:MHC, elemento chave na montagem das respostas imunológicas celulares. Figuras publicadas por Marie-Paule Lefranc (2014) [9], na revista Frontiers in Immunology.

Atualmente o IMGT compreende um total de sete bancos, com mais de 15.000 páginas de recursos online e 17 ferramentas, fornecendo ainda um sistema para a análise de dados genômicos e de expressão para IGs e TCRs. O IMGT fornece ferramentas como IMGT/Collier-de-Perles tool, o qual permite criar representações didáticas das moléculas de interesse do usuário, seguindo o padrão de numeração e nomenclatura desenvolvido pelo IMGT. Esta é uma alternativa muito interessante para o estudo dos diferentes polimorfismos nas moléculas de MHC. Outra ferramenta de destaque é o IMGT/V-QUEST, que permite a análise de sequências nucleotídicas dos domínios variáveis de IGs e TCRs, sendo capaz de identificar os genes V, D e J nas sequências rearranjadas das moléculas estudadas pelo usuário. Além disso, no caso de IGs, a ferramenta consegue identificar as mutações nucleotídicas e as consequentes trocas de aminoácidos oriundas do processo de hipermutação somática, através da comparação com dados de referência do próprio IMGT/V-QUEST. 

Figura 3. Número de publicações no PubMed com os termos "immunoinformatics","reverse vaccinology" e "computational vaccinology", entre os anos de 1998 e 2013.

Sendo um tema central para a imunologia, a vacinologia sempre esteve presente nas discussões em imunoinformática. O termo "vacinologia reversa" foi cunhado em 2000 pelo italiano Rino Rappuoli [10], para se referir a um processo de desenvolvimento de vacinas que se iniciava pela análise de sequências genômicas in silico, seguido pela identificação de alvos e posterior expressão de proteínas recombinantes para testes in vivo. Esta estratégia continua sendo discutida e aplicada, acumulando uma série de resultados interessantes na imunização contra vírus e bactérias [11,12,13]. Mais recentemente começou a se popularizar o termo "vacinologia computacional", que também tem sido discutida como uma alternativa na pesquisa em câncer [14,15]. Independentemente do termo mais utilizado (ou mais adequado), o fato é que o uso de ferramentas computacionais para o desenvolvimento de vacinas é uma realidade que vem ganhando força (Figura 3), sobretudo graças ao crescimento da comunidade de bioinformatas interessados em imunologia e a rápida evolução dos recursos computacionais.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Nota: 
Agradeço ao professor José Artur Bogo Chies (Laboratório de Imunogenética/UFRGS) pelo suporte na pesquisa sobre Imunogenética.

Referências:

1. Kurosawa Y, von Boehmer H, Haas W, Sakano H, Trauneker A, et al. (1981) Identification of D segments of immunoglobulin heavy-chain genes and their rearrangement in T lymphocytes. Nature 290: 565-570.

2. Maki R, Roeder W, Traunecker A, Sidman C, Wabl M, et al. (1981) The role of DNA rearrangement and alternative RNA processing in the expression of immunoglobulin delta genes. Cell 24: 353-365.

3. Schatz DG, Oettinger MA, Schlissel MS (1992) V(D)J recombination: molecular biology and regulation. Annu Rev Immunol 10: 359-383.

4. Fanning L, Bertrand FE, Steinberg C, Wu GE (1998) Molecular mechanisms involved in receptor editing at the Ig heavy chain locus. Int Immunol 10: 241-246.

5. Sanger R, Race RR (1971) Immunogenetics of certain antigens of the red cell membrane. Nouv Rev Fr Hematol 11: 878-884.
6. Salmon C (1971) [Immunogenetics of ABH antigens]. Nouv Rev Fr Hematol 11: 850-862.
7. Petrov RV (1971) [Current problems of immunogenetics]. Zh Mikrobiol Epidemiol Immunobiol 48: 7-12.
8. Giudicelli V, Chaume D, Bodmer J, Muller W, Busin C, et al. (1997) IMGT, the international ImMunoGeneTics database. Nucleic Acids Res 25: 206-211.
9. Lefranc MP (2014) Immunoglobulin and T Cell Receptor Genes: IMGT((R)) and the Birth and Rise of Immunoinformatics. Front Immunol 5: 22.
10. Rappuoli R (2000) Reverse vaccinology. Curr Opin Microbiol 3: 445-450.
11. Vivona S, Gardy JL, Ramachandran S, Brinkman FS, Raghava GP, et al. (2008) Computer-aided biotechnology: from immuno-informatics to reverse vaccinology. Trends Biotechnol 26: 190-200.
12. Donati C, Rappuoli R (2013) Reverse vaccinology in the 21st century: improvements over the original design. Ann N Y Acad Sci 1285: 115-132.
13. Delany I, Rappuoli R, Seib KL (2013) Vaccines, reverse vaccinology, and bacterial pathogenesis. Cold Spring Harb Perspect Med 3: a012476.
14. Pappalardo F, Chiacchio F, Motta S (2013) Cancer vaccines: state of the art of the computational modeling approaches. Biomed Res Int 2013: 106407.
15. Petrizzo A, Tagliamonte M, Tornesello M, Buonaguro FM, Buonaguro L (2014) Systems vaccinology for cancer vaccine development. Expert Rev Vaccines 13: 711-719.

Imunologia molecular In silico – Parte III

 Clusterização Hierárquica e Reatividade Cruzada

A reatividade cruzada de Linfócitos T Citotóxicos (CTLs) é um fenômeno no qual uma mesma população de células CD8+ é capaz de reconhecer e responder contra dois ou mais alvos distintos (um mesmo TCR interage fortemente com mais de um complexo peptídeo:MHC). Esta característica dos CTLs tem aplicações diretas no desenvolvimento de vacinas e em outras áreas da imunologia. Conforme revisado na primeira parte deste post, houve algumas iniciativas de predição de reatividade cruzada baseadas nas sequências dos peptídeos apresentados (Frankild, 2008; De Groot, 2013), mas a compreensão e predição destes padrões de resposta têm se mostrado um desafio muito complexo.

Em um estudo publicado em 2008, uma equipe coordenada pelos pesquisadores alemães Heiner Wedemeyer e Markus Cornberg imunizou um indivíduo saudável com a vacina experimental IC41 (Fytili e cols., 2008). Esta vacina continha um epitopo imunogênico da proteína NS3 do Vírus da Hepatite C (HCV-NS3₁₀₇₃), cuja sequência de aminoácidos era “CINGVCWTV”. Conforme esperado, a vacina induziu a geração de CTLs específicos para este alvo. Em seguida, os pesquisadores recuperaram estes linfócitos e os desafiaram in vitro contra 28 variantes naturais do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, cobrindo os seis genótipos de HCV. A resposta contra a sequência selvagem “CVNGVCWT” do Genótipo 1 (G1-01), que apresenta alta reatividade cruzada com o epitopo vacinal, foi considerada o controle positivo. De acordo com os autores, foi observada uma importante reatividade cruzada com os alvos dos genótipos 4, 5 e 6, bem como com algumas variantes do genótipo 1. Por outro lado, uma fraca resposta foi observada contra os alvos dos genótipos 2 e 3. Em especial, o epitopo G3-18 (“TVGDVMWTV”) foi o único que aboliu completamente o reconhecimento pelos CTLs utilizados no ensaio (Figura 1A).

Figura 1. Comparação entre resultados in vitro e a análise estrutural in silico. (A) Resultados de um ensaio in vitro realizado por Fytili e cols., 2008, no qual uma mesma população de CTLs – específica contra a sequência selvagem do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃ - foi desafiada contra 28 variantes naturais deste alvo. (B-I) Recorte da área de interação com o TCR de alguns destes epitopos, no contexto do HLA-A*02:01, após modelagem pela técnica D1-EM-D2 (Antunes e cols., 2010). Áreas carregadas são apresentadas em azul (positivas) e vermelho (negativas), em uma escala de -10 kT a +10 kT. Complexos com forte reatividade cruzada apresentam grande semelhança estrutural (B-E), enquanto complexos com fraca resposta cruzada (F-I) apresentam diferenças no potencial eletrostático (setas verdes). Modificado de Antunes e cols., 2011.

Conforme apresentado na segunda parte deste post, o nosso grupo desenvolveu uma abordagem para a predição estrutural de complexos pMHC e começou a observar a distribuição do potencial eletrostático na superfície destes complexos. Em um trabalho publicado em 2011, foi realizada a modelagem destes 28 complexos apresentando variantes de HCV no contexto do MHC humano HLA-A*02:01 (Antunes e cols., 2011). Observando a superfície destes complexos, ficou clara a semelhança estrutural entre aqueles que apresentavam reatividade cruzada, em termos de topografia e distribuição de cargas (Figura 1B-E). Por outro lado, os complexos com fraca resposta cruzada apresentavam diferenças no potencial eletrostático, o que era especialmente visível no caso do complexo G3-18 (Figura 1I).

Na tentativa de quantificar estas relações de similaridade, nós delimitamos uma região nas imagens dos complexos e extraímos valores relativos ao histograma de cores (RGB). Estes valores foram utilizados como entrada para uma análise de componentes principais (PCA) que foi capaz de reproduzir os agrupamentos observados in vitro (Figura 2). Observe que, de acordo com o PC1 (que explica a maior parte da variabilidade dos dados), foi possível agrupar todos os complexos do genótipo 3 (G3) em um determinada faixa de valores. Os complexos do genótipo 2 ocupam outra faixa, na qual também se encontram os “mau-respondedores” do genótipo 1. Todos os complexos que apresentaram elevada reatividade cruzada se agrupam em uma faixa distinta, dominada pelos complexos do genótipo 6. Nós também incluímos nesta análise um epitopo de Influenza (IV-NA₂₃₁), cuja reatividade cruzada com o HCV-NS3₁₀₇₃ havia sido descrita previamente (Wedemeyer e cols., 2001), observando que o mesmo se localiza ao lado do epitopo selvagem de HCV.

Figura 2. Distribuição dos complexos de acordo com uma Análise de Componentes Principais (PCA). O único complexo que não apresentou resposta in vitro aparece completamente isolado (G3-18). A distribuição de acordo com o PC1 permite observar faixas que agrupam os complexos do genótipo 3 (G3), os complexos do genótipo 2 (G2) e os complexos do genótipo 6 (G6). O epitopo IV-NA₂₃₁, previamente descrito como alvo de reatividade cruzada com o epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, também se localizou junto ao grupo G6. Modificado de Antunes e cols., 2011.

        Os mesmos resultados foram observados utilizando-se outra abordagem estatística, a análise de clusterização hierárquica (HCA). O HCA também apresentava algumas vantagens práticas para a análise de um volume maior de dados, fornecendo um dendrograma das relações de similaridade entre os complexos. Foi então realizada uma triagem virtual de 55 complexos pMHC não relacionados, incluindo os pMHCs “cross-reativos” de HCV, mas também vários outros pMHCs disponíveis no CrossTope. Para esta abordagem foram utilizados valores de 7 regiões de variabilidade na superfície do pMHC (compatíveis com os footprints dos TCRs), os quais serviram para agrupar os complexos através do HCA (Antunes e cols., 2011).

Conforme esperado, o dendrograma resultante apresentou um agrupamento principal contendo as variantes de HCV. No entanto, este “cluster de HCV” incluía novos complexos. Dois deles se destacaram pela semelhança estrutural com o HCV-NS3₁₀₇₃: o HIV-GAG₇₇ (SLYNTVATL) e o EBV-LMP2₃₂₉ (LLWTLVVLL). Observe que o epitopo de EBV não compartilha nenhum aminoácido com o epitopo selvagem de HCV e que, no entanto, apresentou uma superfície muito semelhante no contexto do HLA-A*02:01. A possível reatividade cruzada entre HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉ não havia sido descrita e este alvo dificilmente teria sido sugerido por qualquer análise baseada em sequência.

Intrigados por nossa predição, o grupo do Professor Markus Cornberg resolveu testar estes alvos, utilizando estimulação ex vivo de linfócitos de pacientes HCV+ e avaliando o reconhecimento dos peptídeos através da marcação intracelular de Interferon-γ e citometria de fluxo. Estes estudos, ainda não publicados, confirmaram a reatividade cruzada entre os alvos HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉, apresentando importantes implicações para o estudo da evolução da infecção por HCV (Zhang, S., comunicação pessoal).

Encerramos assim esta jornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI). Nos próximos posts abordarei outras novidades desta nova fronteira da Imunologia, a “Imunoinformática”. Um Feliz dia dos Namorados a todos (especialmente à Stertz, L.) e boa sorte para a seleção brasileira que estreia hoje no mundial de 2014!!

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Imunologia molecular In silico – Parte II

 A Imunoinformática Estrutural

Conforme apresentado na primeira parte deste post, em 2009 o NBLI teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates. O grupo recebeu um auxílio de U$ 100.000 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I), voltado à identificação de padrões estruturais nestes complexos. No ano seguinte, o NBLI publicou um trabalho descrevendo padrões estruturais apresentados pelos epitopos quando complexados à fenda do MHC (Antunes e cols., 2010), padrão este que não era dependente da sequência do epitopo e que era específico para cada alotipo1 de MHC (Figura 1).

Figura 1. Exemplo da sobreposição de epitopos cristalografados na fenda de MHCs murinos. As estruturas de cinco epitopos restritos a H2-D^b (1CE6, 1S7V, 1WBZ, 1ZHB e 3BUY) e cinco epitopos restritos a H2-K^b (1FO0, 1FZJ, 1LK2, 1RJY e 1S7R) foram sobrepostas. (A) Visão lateral salientando as diferenças conformacionais apresentadas por epitopos no contexto do H2-D^b (vermelho) e do H2-K^b (azul), especialmente entre as posições 5 e 7 (p5-7). (B) Visão superior. (C) Sobreposição de duas estruturas cristalográficas (1S7V e 1S7R) apresentando o mesmo epitopo (KAVYNLATM) no contexto destes dois alotipos distintos. Modificado de Antunes e cols., 2010.

   

      Este trabalho foi realizado a partir da análise de todas as estruturas de pMHCs até então determinadas experimentalmente para alguns dos alotipos de MHC de classe I mais estudados (H2-D^b, H2-K^b, HLA-A*02:01 e HLA-B*27:05), disponíveis no ProteinData Bank. Além do caráter descritivo, a identificação destes padrões permitiu o desenvolvimento de uma nova estratégia de predição de estruturas  de pMHC-I. Trabalhos recentes têm utilizado ferramentas de ancoramento molecular (docking) para a predição estrutural de complexos pMHC (Bordner, 2006; Antunes, 2010; Khan, 2010). O docking é amplamente utilizado para predizer o modo de ligação de fármacos e pequenos ligantes ao sítio ativo de enzimas e receptores proteicos, apresentando resultados rápidos e confiáveis (Morris, 2009; Trott, 2010). No entanto, sua acurácia decai rapidamente com o aumento do número de ligações flexíveis do ligante, o que aumenta o número de conformações possíveis e eleva o custo computacional para a resolução do problema (Chang e cols., 2010). Enquanto a maioria dos algoritmos disponíveis apresenta resultados confiáveis para o ancoramento molecular de ligantes com até 10 ligações flexíveis, um peptídeo típico (apresentado por MHC de classe I) possui cerca de 9 aminoácidos e pode apresentar mais de 40 ligações flexíveis. Neste contexto, a descoberta de padrões conformacionais específicos para cada alotipo de MHC viabiliza o docking de complexos pMHC-I, na medida em que permite reduzir o número de ligações flexíveis do ligante. Esta foi a premissa utilizada no desenvolvimento de uma nova estratégia de predição estrutural de complexos pMHC-I, referida como D1-EM-D2 (Figura 2).

Figura 2. Fluxograma da abordagem D1-EM-D2. A estrutura de um dado complexo pMHC-I, cuja estrutura ainda não é conhecida, pode ser modelada em três etapas: (i) Docking, (ii) Energy Minimization e (iii) Docking (D1-EM-D2). A sequência linear de aminoácidos de um peptídeo pode ser utilizada como entrada para um script do PyMOL (a), o qual gera um arquivo de coordenadas espaciais (PDB) para o epitopo alvo, ajustando a conformação da cadeia principal ao padrão “alotipo-específico”. Uma estrutura de referência contendo o alotipo de interesse é utilizada como “Doador de MHC”, removendo-se o peptídeo da fenda. O “Doador de MHC” e o “Epitopo 3D” são utilizados como entrada para o ancoramento molecular (docking) com o Autodock Vina (b), gerando um novo pMHC-I. Um ciclo de otimização da estrutura é realizado para ajustar o “Doador de MHC” ao novo epitopo. Modificado de Sinigaglia e cols., 2013.

Mesmo considerando-se apenas os genes clássicos de MHC em humanos (HLA-A, HLA-B e HLA-C)2, já são descritos mais de 8.000 alelos3, dos quais uma parcela insignificante possui estrutura conhecida. Cada um destes alelos codifica a cadeia pesada de um alotipo de MHC capaz de apresentar milhares de peptídeos, muitos dos quais seriam de grande interesse para estudos de imunologia (variantes virais, autoantígenos, epitopos que apresentam reatividade-cruzada, etc). Muitos avanços foram feitos no campo da Cristalografia de Raios-X e da Ressonância Magnética Nuclear, permitindo a determinação experimental de um número cada vez maior de estruturas proteicas. No entanto, estes métodos continuam sendo extremamente caros e demorados. Assim sendo, considerando-se a magnitude e a variabilidade deste sistema, análises estruturais em larga escala de complexos pMHC-I seriam praticamente inviáveis sem o auxílio de métodos in silico, rápidos, precisos e de baixo custo.

A abordagem D1-EM-D2 foi amplamente validada em comparação com estruturas cristalográficas, sendo então aplicada na predição em larga escala de complexos pMHC-I apresentando peptídeos imunogênicos. Estes complexos foram posteriormente disponibilizados em um banco de dados específico, o CrossTope (Sinigaglia, 2013). Juntamente com o arquivo contendo as coordenadas espaciais do complexo, o CrossTope disponibiliza informações sobre o alelo de MHC, a proteína e o organismo de origem do epitopo apresentado, etc. São fornecidos links para bancos com informações complementares, como o IEDB e o NCBI. Além disso, o banco fornece uma imagem do potencial eletrostático sobre a superfície do pMHC que fará contato com o TCR. Estudos recentes indicam que características estruturais desta superfície, como cargas e topografia, podem direcionar o reconhecimento pelos linfócitos T CD8+ (Sandalova, 2005; Antunes, 2011; Shen, 2013). De acordo com resultados in vitro, mesmo a troca de um único aminoácido pode abortar o reconhecimento por uma dada população de linfócitos (Fytili, 2008).

Figura 3. Potencial eletrostático na superfície de interação com o TCR. A imagem mostra a vista superior de três complexos pMHC formados por variantes de um mesmo epitopo (com trocas por alanina), no contexto do HLA-A*02:01. Observe a posição dos domínios α1  e α2 do MHC, entre os quais se localiza o epitopo. Regiões com cargas positivas (azuis) e negativas (vermelhas) são representadas em uma escala de -5 kT a +5 kT. As superfícies de complexos que estimulam altos níveis de IFN-gamma frente a uma população de linfócitos específica contra o tipo selvagem (CVNGVCWTV) são muito semelhantes (A e B), enquanto diferenças de topografia e cargas (setas verdes) são visíveis na superfície de um complexo que estimula fracamente a mesma população de linfócitos (C). Modificado de Antunes e cols., 2010.

Além de continuar trabalhando no aperfeiçoamento e automatização da abordagem para predição estrutural de complexos pMHC-I, nosso grupo tem especial interesse na predição de reatividade-cruzada entre epitopos virais. Na terceira e última parte deste post, serão apresentados resultados referentes ao uso de estatísticas multivariadas para a triagem virtual de complexos pMHC-I. Esta abordagem baseada em estrutura nos permitiu predizer uma reatividade-cruzada até então desconhecida, entre epitopos que não compartilhavam nenhum aminoácido em sua sequência, um resultado que já está sendo confirmado por experimentos in vitro.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

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1 A expressão “alelos de MHC” é usualmente utilizada para referenciar tanto as variantes dos genes quanto as diferentes proteínas codificadas por estas variantes gênicas. No entanto, este segundo uso da expressão não é adequado uma vez que o termo “alelo” se refere especificamente a DNA, não a proteína. A expressão “alotipo” é indicada para referenciar as diferentes proteínas codificadas por alelos de MHC.

2 A cadeia pesada do complexo responsável pela apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular é referida genericamente como MHC de classe I (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), mas a nomenclatura varia de acordo com a espécie. Por exemplo, em humanos ele recebe o nome HLA (na sigla em inglês para Human Leukocyte Antigen), em camundongos é referido como antígeno H2, etc.

3 Até as 14 horas de Quarta-Feira, dia 07/05/2014, havia 8.124 alelos de MHC de classe I listados no http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html.

Imunologia molecular In silico – Parte I

Buscando padrões em sequências virais

O Professor José Artur Bogo Chies coordena o Laboratório de Imunogenética da UFRGS, localizado no Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, onde desenvolve pesquisas com enfoque nas análises genéticas de doenças com fundo autoimune e pró-inflamatório. Durante uma aula sobre apresentação de antígenos, para uma turma da graduação, foi surpreendido pela pergunta de um aluno sobre as características que permitiam ao sistema imune diferenciar próprio e não próprio.  Gustavo Fioravanti Vieira, então aluno do curso de Biologia, estava intrigado sobre o reconhecimento de peptídeos virais apresentados no contexto do MHC-I. Além da questão da seleção tímica e da possível influência do contexto inflamatório da infecção, haveria algum padrão nestes pequenos peptídeos apresentados pelas células infectadas que pudesse servir como uma “assinatura” típica de vírus? Afinal, as proteínas virais são formadas pelos mesmos 20 aminoácidos essenciais que formam as proteínas do hospedeiro e o linfócito CD8+ irá interagir com uma sequência de apenas 8-10 aminoácidos para “identificar” se o alvo apresentado é próprio ou não próprio. 

Figura 1. Rota de apresentação de peptídeos endógenos. Modificado de Yewdell e cols., 2003.

Muitos meses mais tarde, este despretensioso debate em sala de aula deu origem a uma nova linha de pesquisa no Laboratório de Imunogenética. O Professor José Artur convidou o ex-aluno (agora Bacharel em Biologia) para ingressar em um projeto de mestrado realizando uma análise in silico (no computador) das sequências de peptídeos virais imunogênicos. Sob co-orientação do Dr. Andrés Delgado Cañedo (Unipampa), Gustavo Vieira iniciou uma pesquisa voltada a identificação de padrões físico-químicos que pudessem ser responsáveis pelo desencadeamento de reatividade cruzada nas respostas celulares citotóxicas (Vieira & Chies, 2005). A existência de padrões físico-químicos que contribuíam para a ocorrência da reatividade cruzada entre epitopos virais foi posteriormente corroborada por experimentos realizados por pesquisadores dinamarqueses (Frankild e cols., 2008).

O projeto de Mestrado foi transformado em Tese de Doutorado e através do uso da ferramenta BLAST e de preditores das etapas da via de apresentação de antígenos endógenos foi possível identificar que os epitopos imunogênicos estavam restritos a regiões conservadas das proteínas virais (Rigo e cols., 2012). Ou seja, utilizando a proteína N dos Hantavírus como modelo de estudo, observou-se in silico que o sistema imunológico dos hospedeiros (roedores) direcionava a resposta celular contra epitopos compartilhados entre os diversos membros da família Bunyaviridae (blocos azul escuro na Figura 2). Estas sequências, por outro lado, não compartilhavam nenhuma similaridade com sequências do hospedeiro ou mesmo com sequências de outros organismos (mesmo considerando padrões físico-químicos). Estas observações são suportadas pela comparação entre a proteína N e proteínas da ordem Rodentia (hospedeiros naturais dos hantavírus) através de um sistema de janela deslizante, bem como por uma busca de motifs utilizando a ferramenta Pattern Search (Max Planck Institute). Assim sendo, a estimulação da resposta celular por estes alvos conservados potencializa a chance de imunização heteróloga (infecção pelo vírus “A” protege contra o vírus “B”) e reduz o risco de respostas autoimunes.

Figura 2. Alinhamento da proteína de nucleocapsídeo de 34 virus da família Bunyaviridae. Os blocos  acima do alinhamento indicam a localização de epitopos descritos em murinos (azul escuro) ou humanos (azul claro). Na parte superior da imagem a identidade é indicada por um histograma de cores, no qual o verde indica 100% de identidade. Observe que os epitopos murinos (hospedeiro natural) se encontram em blocos com identidade mais alta do que aquela observada para alguns epitopos descritos em humanos. Modificado de Rigo e cols., 2012.

Neste “contexto imunológico” se desenvolveu o Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI), coordenado por Gustavo Fioravanti Vieira, agora Professor Colaborador do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGBM-UFRGS). Com o tempo, o enfoque das pesquisas do grupo voltou-se da análise de sequências para a análise de estruturas, mantendo sempre o interesse central nos mecanismos da reatividade cruzada e da imunidade heteróloga. Em 2009 o grupo teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates, tendo recebido um auxílio de U$ 100.000,00 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I). Os resultados desta nova linha de pesquisa serão apresentados na segunda parte deste post.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).