DockTope: Um portal gratuito e simples para a predição estrutural de complexos peptídeo-MHC

Autor: Dinler Amaral Antunes, Bacharel em Biomedicina pela UFRGS, Mestrado e Doutorado pelo PPGBM/UFRGS e pós-doutorado pela Rice University (Texas/EUA).

    O ancoramento molecular (ou docking) tem sido amplamente utilizado para predizer a estrutura de complexos proteína-ligante, tanto na academia quanto na indústria [1]. Existe uma grande diversidade de programas, oferecendo recursos para abordar diferentes problemas e diferentes níveis de flexibilidade do sistema [2]. Na imunologia, uma das mais interessantes aplicações do docking diz respeito a predição de complexos peptideo-MHC de classe I (pMHC-I) [3,4], um componente central para a resposta imunológica celular. Esta aplicação, no entanto, não é trivial.

    Para predizer a conformação mais provável de um ligante na fenda do receptor o programa de docking deve explorar todas as ligações flexíveis do ligante, bem como movimentos de rotação e translação. Na maioria dos casos o docking é aplicado para ligantes pequenos (até 10 ligações flexíveis), sendo que a acurácia e a performance das predições decai com o aumento da flexibilidade do ligante [5,6]. Ligantes peptídicos representam um desafio particular para o docking, uma vez que apresentam uma cadeia principal bastante flexível e cadeias laterais que podem também adotar uma diversidade de conformações. Um estudo recente salientou a limitação dos protocolos convencionais na predição estrutural de ligantes peptídicos com até 5 resíduos [7]. Estes dados salientam o enorme desafio referente a aplicação de ferramentas de docking à moléculas de MHC de classe I, uma vez que os ligantes envolvidos são peptídeos contendo entre 8 e 11 resíduos e mais de 35 ligações flexíveis.

    Tendo em vista a importância da análise estrutural de complexos pMHC-I e as limitações dos métodos experimentais para a resolução destas estruturas (sobretudo considerando-se a grande variabilidade deste sistema), diversas abordagens foram propostas para tentar viabilizar a predição estrutural in silico de complexos pMHC-I. Dentre os exemplos mais notáveis, eu saliento o trabalho pioneiro de Andrew Bordner [3,9], bem como as ferramentas DynaPred, MHCsim e pDOCK. Apesar de apresentarem sucesso em casos particulares, estas ferramentas possuem limitações importantes e na maioria dos casos envolvem o uso de diferentes softwares e até mesmo pacotes pagos. O único desta lista que foi disponibilizado na forma de um servidor online foi o MHCsim, que na verdade não realiza a predição por docking, mas apenas converte uma estrutura conhecida (cristal) no complexo de interesse ("mutando" as posições discordantes).

    Em 2010, um grupo da UFRGS publicou um protocolo para a predição estrutural de complexos pMHC-I combinando etapas de docking e minimização de energia [10]. O protocolo foi explicado em um post anterior aqui do blog. Assim como os métodos descritos anteriormente, este protocolo envolve uso de diferentes programas e uma série de etapas de preparação e conversão de arquivos, dificultando seu uso por outros pesquisadores. No entanto, um esforço foi feito para automatizar todas as etapas e implementar o protocolo em um servidor que pudesse ser acessado livremente, sem exigir do usuário qualquer conhecimento de bioinformática. Assim surgiu o DockTope, a nova alternativa para a predição estrutural de complexos pMHC-I. Basta escolher o alelo de MHC de interesse, fornecer a sequência do peptídeo e aguardar o resultado. A técnica depende da utilização de padrões estruturais compartilhados entre peptídeos apresentados por um mesmo alelo de MHC, os quais foram determinados para 4 alelos de MHC até o momento [10]. Apesar de existirem exceções a estes padrões, um artigo publicado recentemente na Scientific Reports demonstrou a robustez do método [4]. A técnica foi empregada na reprodução de 135 estruturas cristalográficas de complexos pMHC-I (não redundantes), apresentando um valor médio de RMSD para todos os átomos do ligante inferior a 2 Å (abaixo da resolução média dos cristais utilizados, Figura 1).

Figura 1. Valores médios de RMSD (Root Mean Square Deviation)
 para as 135 estruturas cristalográficas reproduzidas, considerando-se
carbono alfa (azul) ou todos os átomos do ligante (vermelho). Valores
médios de resolução dos cristais reproduzidos também são
apresentados (verde) para comparação.

    Além do sucesso na reprodução de estruturas cristalográficas, predições baseadas nos modelos gerados foram confirmadas com dados experimentais [11,12,13]. Com base na similaridade estrutural dos modelos de complexos pMHC-I foi possível predizer eventos de reatividade cruzada de linfócitos T, envolvendo peptídeos de diferentes vírus e com baixa similaridade de sequencia [13]. Estes dados reforçam a validade biológica dos modelos gerados, salientando a aplicabilidade deste método para o desenvolvimento de vacinas.

   O DockTope já está sendo aplicado em larga escala para modelar uma série de alvos (principalmente peptídeos virais) os quais estão sendo depositados em um banco de dados desenvolvido pela mesma equipe, o CrossTope [14]. Neste site o usuário pode pesquisar os complexos que já foram modelados e obter informações sobre o receptor e o ligante, bem como links para outros bancos de dados. Também é possível comparar complexos de interesse e observar o potencial eletrostático da superfície de interação com o TCR. Apesar de possibilitar a modelagem de um número restrito de alelos de MHC, o DockTope inclui justamente alelos de elevado interesse para os imunologistas. O HLA-A*02:01 é um dos mais frequentes alelos em humanos [15] e o alelo HLA-B*27:05 foi associado ao controle da infecção por HIV e HCV [16,17,18], bem como a eventos de autoimunidade (ex.: espondilite anquilosante) [19].

Limitações: Conforme mencionado anteriormente, já foram identificados alguns exemplos de exceções aos padrões utilizados para modelar a cadeia principal dos peptídeos [10]. Até o momento não é possível identificar com base na sequência se o alvo de interesse será uma destas exceções, então existe um erro associado a técnica. Este tipo de incerteza é comum a qualquer método de predição e os dados de reprodução de cristais mencionados anteriormente reforçam a ideia de que a técnica é bem sucedida na maioria dos casos, pelo menos para estes alelos (HLA-A*02:01, HLA-B*27:05, H2-Db, H2-Kb). É possível observar na Figura 1 que a média de RMSD das reproduções para HLA-B*27:05 foi mais alta que para os demais alelos, o que salienta a complexidade associada a flexibilidade do ligante. Peptídeos restritos a este alelo apresentam um conteúdo maior de argininas, as quais possuem longas cadeias laterais, sendo particularmente difíceis de predizer com acurácia. Nesta primeira fase, o DockTope não permite que o usuário modele múltiplos alvos ao mesmo tempo, o que dificulta a modelagem de um conjunto grande de complexos. Estas restrições devem ser flexibilizadas em um segundo momento, a medida que for confirmada a demanda pelo serviço. 

Predição da estabilidade dos complexos peptídeo:MHC e o "desprendimento" do ligante

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA

Figura 1. Ilustração de Eric Reits para representar a rota 
de apresentação de peptídeos endógenos. Uma amostra 
das proteínas intracelulares é processada e apresentada
na superfície celular no contexto do MHC-I, permitindo seu
 reconhecimento pelos linfócitos T (Yewdell et al., 2003).

    A apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular representa uma rota central para a resposta imunológica adaptativa. Este mecanismo, presente em praticamente todas as células nucleadas do organismo, possibilita que linfócitos T circulantes (CD8+) "fiscalizem" o conteúdo intracelular destas células apresentadoras, permitindo a detecção de infecções virais e tumores. Esta rota pode ser explicada de maneira simples, sendo visivelmente uma espécie de "controle de qualidade" do conteúdo intracelular (Figura 1). Os detalhes moleculares desta rota, no entanto, são bastante complexos e variáveis. Por exemplo, se tentarmos entender quais são os requisitos responsáveis pela capacidade de um peptídeo de desencadear a ativação de um linfócito, perceberemos o envolvimento de múltiplas variáveis relacionadas a diferentes etapas deste processo. Em primeiro lugar, o peptídeo precisa ser capaz de "sobreviver" ao processamento, uma vez que nem todos os possíveis peptídeos contidos em uma dada proteína são apresentados na superfície (Yewdell et al., 2003). Um ponto importante nesta etapa de processamento diz respeito a capacidade de ligação dos peptídeos gerados às moléculas de MHC de classe I (sigla em inglês para Complexo Principal de Histocompatibilidade). Hoje temos acesso a uma ampla coleção de dados sobre ligação de peptídeos a moléculas de MHC e é possível inclusive predizer a afinidade de ligação do complexo considerando-se as sequências das moléculas envolvidas (Backert & Kohlbacher, 2015; Karosiene et al., 2012). No final desta rota, o conjunto peptídeo:MHC (pMHC) poderá interagir com linfócitos circulantes e o desfecho da resposta dependerá de uma série de fatores envolvidos na afinidade da interação entre o pMHC e o receptor de linfócito T (ou TCR, na sigla em inglês). Em um capítulo de livro publicado em 2012 nós utilizamos o termo reatividade para nos referirmos a esta etapa final e os fatores envolvidos na ativação dos linfócitos T citotóxicos. No mesmo capítulo, nós discutimos a importância de um "nível de seleção" intermediário entre o processamento e a reatividade, relativo a estabilidade do complexo pMHC.
    Embora intuitivamente possamos imaginar que a estabilidade de um dado pMHC será um reflexo da afinidade de ligação do complexo, de modo que apenas pMHCs estáveis serão formados no retículo endoplasmático e consequentemente apresentados na superfície, esta relação nem sempre é observada. Na verdade, os dados sugerem que a estabilidade do pMHC é inclusive um melhor preditor da imunogenicidade do peptídeo do que a própria afinidade de ligação (van der Burg at al., 1996; Harndahl et al., 2012; Jorgensen et al. 2014). Embora os já conhecidos "resíduos âncoras" sejam primariamente envolvidos na afinidade do complexo, as cadeias laterais de outros resíduos secundários podem influenciar positivamente ou negativamente na manutenção do modo de ligação mais favorável, o que pode levar a instabilidade do complexo (Jorgensen et al. 2014). Isso acaba tendo impacto direto na possível estimulação de linfócitos, sobretudo considerando que uma diversidade de peptídeos está sendo apresentada ao mesmo tempo e que estes diferentes complexos pMHC estão competindo pela interação com o TCR; complexos mais numerosos e mais estáveis tem maior chance de serem reconhecidos (dependendo também dos fatores envolvidos na reatividade).

Figura 2. Visualização dos dados obtidos de uma dinâmica
 molecular de um complexo pMHC não estável. Os cones
verdes indicam a direção e a intensidade das forças
observadas em determinados resíduos. Neste exemplo,
elas indicam uma forte tendência de desprendimento
da porção C-terminal do ligante. Estes dados diferem
daqueles observados para um ligante controle. Modificado
 da Tese de Doutorado de Maurício M. Rigo (2015). 

    O servidor netMHCstab utiliza redes neurais para predizer a estabilidade de um dado complexo pMHC com base na análise de sequencias, tendo apresentado resultados promissores na identificação de epitopos de linfócito T quando combinado a um método consenso para predição de afinidade de ligação ao MHC (Jorgensen et al. 2014). No entanto, estes métodos baseados em análise de sequência são muito dependentes da qualidade e do volume de dados utilizado para treinar as predições (Wang et al., 2014). Esta restrição muitas vezes impede a generalização das predições para outros alelos de MHC ou outros tamanhos de ligantes, visto que os dados experimentais ainda são limitados para a maioria dos alelos (considerando-se apenas os MHCs de classe I clássicos, são mais de 10 mil alelos descritos em humanos). Métodos estruturais tem potencial para permitirem uma maior generalização das predições, especialmente considerando-se uma característica dinâmica como estabilidade. Em tese, tendo-se uma estrutura inicial do complexo é possível calcular as forças envolvidas na interação e simular o comportamento do complexo em solução. Durante seu trabalho de Doutorado desenvolvido na UFRGS, meu colega Maurício Menegatti Rigo utilizou métodos de docking e dinâmica molecular para estudar a estabilidade de ligantes na fenda do MHC. Utilizando dados obtidos de simulações considerando a real estrutura das moléculas envolvidas (full-atom MD) foi possível observar claros sinais de instabilidade em peptídeos mutados (Figura 2), além de identificar algumas interações que parecem ser mais importantes para a manutenção do modo de ligação.
    A dinâmica molecular é a ferramenta de bioinformática estrutural com a maior precisão em termos da correta descrição das forças envolvidas e das trajetórias moleculares preditas para um dado sistema. No entanto, esta precisão acarreta um elevado custo computacional que em muitos casos inviabiliza a análise de sistemas muito grandes, ou a observação de eventos que ocorrem em escalas de tempo superiores a centenas de microssegundos. O trabalho descrito acima corrobora o potencial preditivo da dinâmica molecular quanto a instabilidade do complexo, mas nestas simulações curtas (20 ns) não é possível observar o completo "desprendimento" do ligante. Na verdade, um trabalho recente demonstrou que o desprendimento completo pode não ser observado mesmo em uma dinâmica molecular de 1000 ns (1 µs), a mais longa simulação de um complexo pMHC já publicada (full-atom MD) (Knapp et al., 2015). Para conseguir observar este evento em nível molecular, os autores implementaram uma estratégia alternativa. Em primeiro lugar, ao invés de considerar a descrição atômica das moléculas envolvidas, eles utilizaram uma representação simplificada dos resíduos (coarse-grained 3-point model). Em segundo lugar, eles utilizaram um método de segmentação hierárquica da proteína para restringir a flexibilidade de grupos de resíduos, o que também melhora a performance (reduz graus de liberdade) e previne a perda do correto enovelamento da proteína (unfolding). Os movimentos neste sistema foram então explorados através do método de Monte Carlo. Finalmente, eles realizaram repetidas etapas de simulated annealing para permitir uma rápida exploração do espaço conformacional sem ficar restrito a mínimos locais de energia. Esta abordagem permitiu observar o completo desprendimento da fenda em um tempo computacionalmente viável (Figura 3) e foi capaz de discriminar entre ligantes e não ligantes (AROC = 0,85). Esta é a primeira vez em que são descritas conformações intermediárias do ligante durante o processo de desprendimento do MHC, possibilitando novos insights e revelando outros detalhes moleculares importantes para o desencadeamento de uma resposta imunológica celular. A capacidade de predizer dados experimentais corrobora a hipótese de que as simplificações realizadas não prejudicaram a correta descrição das moléculas simuladas, mas futuros experimentos serão necessários para determinar a real acurácia e a potencial generalização dos resultados observados.

Figura 3. Simulação do processo de desprendimento de um peptídeo da fenda do MHC utilizando (A) uma nova metodologia baseada em coarse-grained Monte Carlo e simulated annealing (HNMMC) ou (B) dinâmica molecular. O peptídeo utilizado (AAAKTPVIV) foi previamente descrito como não ligante de HLA-A*0201, alelo utilizado nestes experimentos. A técnica HNMMC foi capaz de descrever um completo desprendimento da fenda, em um tempo muito inferior ao da dinâmica molecular (C). Figura publicada em Knapp et al., 2015.

Infecções prévias com vírus heterólogos alteram a resposta individual à vacinação

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

Figura 1.: Rede de reatividade cruzada envolvendo o alvo vacinal HCV-NS31073. Similaridade estrutural no contexto do MHC foi indicada como possível mecanismo para o desencadeamento de imunidade heteróloga, enquanto variabilidade individual e direcionalidade nas respostas observadas foram atribuídas ao histórico de infecções e o repertório privado de linfócitos T (Zhang e cols., 2015).

  A influência de infecções prévias sobre a resposta a novos desafios imunológicos não é nenhuma novidade para os imunologistas. O processo de imunização altera a composição do conjunto de linfócitos de memória de modo que algumas populações são expandidas, em detrimento de outras (Welsh & Selin, 2002). A imunidade heteróloga entre vírus parece ter um papel central neste contexto, sendo por sua vez moldada pelo repertório privado (individual) de linfócitos T CD8+ e por eventos de reatividade cruzada no reconhecimento de complexos peptideo:MHC (Welsh e cols., 2010). 

 Apesar de estes mecanismos serem reconhecidos, ainda nos surpreende quando respostas específicas para determinado alvo viral são encontradas em indivíduos que não tiveram exposição prévia a este patógeno. Pode uma simples gripe ou uma virose transmitida pelo beijo gerar algum nível de imunidade contra o Vírus da Hepatite C (HCV), por exemplo? Por mais incrível que pareça, eventos desta natureza já foram relatados em trabalhos prévios (Wedemeyer e cols., 2001), sendo provavelmente mais frequentes do que imaginávamos (Selin e cols., 2011). Em um trabalho recentemente publicado no Journal of Virology, Zhang e colaboradores (2015) descrevem a presença de linfócitos específicos para um alvo imunogênico de HCV (NS31073) em um terço dos indivíduos soronegativos para para este vírus, independente de fatores de risco para exposição a HCV. Análises ex vivo indicaram a presença tanto de células virgens quanto de células de memória, sugerindo que pelo menos uma parcela da resposta deve ser mediada por linfócitos originalmente expandidos na presença de vírus heterólogos (Figura 1).

  Uma análise de bioinformática estrutural (utilizando metodologia previamente descrita no SBlogI) sugeriu diferentes epitopos virais (derivados de EBV, CMV e Influenza) como possíveis alvos de reatividade cruzada, predições estas confirmadas em pelo menos uma parcela dos indivíduos. Cabe salientar que um destes alvos, EBV-LMP2329 (LLWTLVVLL), não apresenta qualquer similaridade de sequência com o epitopo HCV-NS31073 (CINGVCWTV), mas apresenta grande similaridade estrutural no contexto do MHC (Figura 2).

Figura 2.: Recorte da superfície dos complexos peptídeo:MHC, apresentando diferentes peptídeos virais no contexto da mesma molécula de MHC (HLA-A*02:01). Os domínios alfa-1 e alfa-2 da molécula de MHC, que flanqueiam o epitopo, são indicados. As cores indicam a distribuição do potencial eletrostático na superfície (vermelho = negativo, azul = positivo, branco = neutro). Neste conjunto, os alvos EBV-K1217 e EBV-BARF0356 apresentaram maior diferença em termos de potencial eletrostático (comparação utilizando agrupamento hierárquico). Alvos apresentando maior similaridade estrutural com o peptídeo vacinal de HCV (NS31073), considerando a superfície de interação com o TCR, foram selecionados para testes in vitro e respostas cruzada foram observadas em uma parcela dos indivíduos testados.

  O epitopo HCV-NS31073  foi previamente incluído na composição de uma vacina experimental anti-HCV, a qual foi utilizada por Zhang e colaboradores (2015) para imunizar indivíduos saudáveis. Acompanhando este grupo vacinado, os autores observaram resposta mais intensa e mais rápida nos indivíduos que apresentavam linfócitos específicos para HCV-NS31073 previamente a vacinação. Em conjunto, estes dados reforçam a hipótese de que a existência de células T "cross-reativas" previamente a imunização seja uma das variáveis responsáveis pela variabilidade individual à vacinação. A reatividade cruzada de células T parece ser mais comum do que previamente estimado, sendo possível até mesmo entre epitopos com baixa similaridade de sequência e podendo envolver diferentes alvos virais. Em conjunto com a variabilidade individual para a produção de linfócitos T (repertório privado), o histórico de infecções aumenta a variabilidade individual da resposta a vacinas e aponta para a necessidade de estratégias personalizadas. Outra questão importante se refere a "qualidade" desta resposta cruzada e a capacidade de estabelecer uma imunidade protetora, visto que respostas cruzadas fracas podem mediar infecção crônica e imunopatologia (Selin e cols., 2011, Wlodarczyk e cols., 2013).

  Embora vacinas personalizadas e avaliações em larga-escala do histórico pessoal de infecções virais ainda não sejam uma realidade, novas tecnologias estão sendo desenvolvidas neste sentido. Uma publicação recente da revista Science descreve uma nova abordagem - rápida e barata - para detectar o histórico de infecções virais de um indivíduo (veja artigo do The Guardian). Metodologias como esta podem ter grande impacto no diagnóstico de doenças, na descoberta de novas associações entre infecções virais e a progressão de diferentes patologias humanas, bem como no desenvolvimento de vacinas mais seguras e mais eficientes. 

Agrupando MHCs em supertipos

    Evidentemente a atividade fisiológica do chamado "complexo principal de histocompatibilidade" (MHC, na sigla em inglês) não tem qualquer relação com "histocompatibilidade" em transplantes de órgãos e tecidos, uma situação "artificial", desenvolvida pela medicina moderna, que não ocorre na natureza. A atividade desta molécula está vinculada a resposta imunológica, sendo responsável pela apresentação de peptídeos na superfície celular (conforme discutido em diversos posts do SBlogI). Uma característica marcante desta molécula, sobretudo com relação ao chamado MHC de classe I (MHC-I), é a variabilidade polimórfica. A "região do MHC", no braço curto do cromossomo 6 humano (6p21.3), é a região mais polimórfica e com a maior densidade de genes em todo o genoma humano [1,2]. Atualmente são conhecidos mais de 9 mil alelos de MHC-I em humanos e mais de 3 mil alelos de MHC-II, segundo dados do hla.alleles.org. Toda esta variabilidade, somada ao papel desta molécula na resposta imunológica, acaba tendo consequências diretas sobre a rejeição aos transplantes [3], o que explica o contexto em que o MHC foi descoberto e a razão de ter recebido um nome que não identifica sua "real" função biológica.

   Identificar os alelos de MHC e a consequente compatibilidade entre doadores se tornou algo essencial para a imunologia clínica e rapidamente os diversos alelos de MHC começaram a ser agrupados em sorotipos, conforme seu reconhecimento em testes com anticorpos. Posteriormente esta identificação passou a ser substituída pelo sequenciamento dos genes de MHC e por métodos baseados em PCR [3], uma vez que a resolução dos métodos sorológicos não parecia ser suficiente. 

  A capacidade de "agrupar" alelos de MHC de acordo com suas similaridades também tem outra importante aplicação, o desenvolvimento de vacinas. Os diferentes alelos de MHC apresentam especificidade para um conjunto diferente de peptídeos, consequentemente cada indivíduo poderá responder de formas distintas a um dado alvo antigênico. Uma vez conhecidas as frequências dos alelos e os grupos predominantes, pode se tornar possível desenhar vacinas que tenham maior cobertura na população de interesse [4]. Em 1999, Alessandro Sette e John Sidney introduziram o conceito de "Supertipo" para os alelos de MHC-I [4]. Analisando os conjuntos de peptídeos apresentados pelos alelos de MHC conhecidos (utilizando dados experimentais), eles foram capazes de agrupar 80% dos 945 alelos avaliados em apenas nove supertipos: A1, A2, A3, A24, B7, B27, B44, B58 e B62 [4,5]. Embora a nomenclatura destes grupos, bem como a própria nomenclatura dos alelos de MHC, faça referência as formas de classificação anteriores, a análise baseada nos ligantes revela um padrão de agrupamento muito diferente. Os alelos HLA-A*68:01 e HLA-A*68:02, por exemplo, pertencem ao mesmo sorotipo (HLA-A68) e diferem entre si por apenas 5 polimorfismos [6]. Três destes polimorfismos se localizam no chamado "F pocket", uma das cavidades na fenda de ligação ao peptídeo. Estes polimorfismos, portanto, não são acessíveis aos anticorpos utilizados na classificação sorológica, o que explica seu agrupamento no mesmo sorotipo. Por outro lado, eles alteram dramaticamente a especificidade da fenda destes MHCs, de modo que a análise dos ligantes classifica os alelos HLA-A*68:01 e HLA-A*68:02 em dois supertipos distintos, A3 e A2, respectivamente [5,6]. 

 O trabalho pioneiro de Sette & Sidney abriu caminho para uma série de outras abordagens computacionais, tentando aprimorar esta classificação em supertipos. Apesar de suas diferenças, estes trabalhos podem ser divididos em pelo menos três abordagens principais: (i) baseadas nos ligantes [4,7,8,9], (ii) baseados nas proteínas (MHC) [10] e (iii) estratégias que combinam as informações de ambas as fontes [5,11,12,13]. Lembrando que as abordagens baseadas em proteína (ou combinadas) tentam agrupar os MHCs com base nos motifs dos pockets ou alguma propriedade estrutural, uma vez que a maior parte da sequência dos MHCs é conservada e seu alinhamento leva a agrupamentos incorretos [9]. Alguns novos supertipos foram propostos, bem como a possível divisão de alguns dos supertipos originais [6,9], mas de modo geral estes trabalhos concordam que a maioria dos alelos analisados podem ser classificados em um grupo reduzido de supertipos. Infelizmente o número de alelos analisados ainda é bem menor que o número de alelos conhecidos (volume reduzido de dados para a maioria dos alelos), mas o refinamento destes métodos poderá ter implicações em diversas áreas da imunologia, nos auxiliando a compreender (e quem sabe manipular) pelo menos uma parte da enorme variabilidade envolvida nas repostas imunológicas.

Figura 1. Classificação dos alelos de MHC-I humanos em supertipos, segundo publicação recente de Harjanto e colaboradores [13].

Referências:

1. Vandiedonck C and Knight JC. The human Major Histocompatibility Complex as a paradigm in genomics research. Brief Funct Genomic Proteomic. (2009a) 8:379-394.

2. Xie T, Rowen L, Aguado B, Ahearn ME, Madan A, Qin S, Campbell RD and Hood L. Analysis of the gene-dense major histocompatibility complex class III region and its comparison to mouse. (2003) Genome Res 13:2621-2636.

3. Tiercy JM. Molecular basis of HLA polymorphism: implications in clinical transplantation. Transpl Immunol. 2002 May;9(2-4):173-80.

4. Sette A, Sidney J. Nine major HLA class I supertypes account for the vast preponderance of HLA-A and -B polymorphism. Immunogenetics. 1999 Nov;50(3-4):201-12.

5. Sidney J, Peters B, Frahm N, Brander C, Sette A. HLA class I supertypes: a revised and updated classification. BMC Immunol. 2008 Jan 22;9:1. 

6. Niu L, Cheng H, Zhang S, Tan S, Zhang Y, Qi J, Liu J, Gao GF. Structural basis for the differential classification of HLA-A*6802 and HLA-A*6801 into the A2 and A3 supertypes. Mol Immunol. 2013 Oct;55(3-4):381-92.

7. Reche PA, Reinherz EL: Definition of MHC supertypes through clustering of MHC peptide binding repertoires. LNCS, ICARIS 2004, 3239:189-196.

8. Lund O, Nielsen M, Kesmir C, Petersen AG, Lundegaard C, Worning P, Sylvester-Hvid C, Lamberth K, Roder G, Justesen S, et al. Definition of supertypes for HLA molecules using clustering of specificity matrices. Immunogenetics 2004, 55:797-810.

9. Thomsen M, Lundegaard C, Buus S, Lund O, Nielsen M. MHCcluster, a method for functional clustering of MHC molecules. Immunogenetics. 2013 Sep;65(9):655-65. 

10. Doytchinova IA, Guan P, Flower DR: Identifiying human MHC supertypes using bioinformatic methods. J Immunol 2004, 172:4314-23.

11. Hertz T, Yanover C: Identifying HLA supertypes by learning distance functions. Bioinformatics 2007, 23:e148-55. 

12. Tong JC1, Tan TW, Ranganathan S. In silico grouping of peptide/HLA class I complexes using structural interaction characteristics. Bioinformatics. 2007 Jan 15;23(2):177-83.

13. Harjanto S, Ng LF, Tong JC. Clustering HLA class I superfamilies using structural interaction patterns. PLoS One. 2014 Jan 27;9(1):e86655. 

Post de Dinler Amaral Antunes

Complimentary Postdoctoral Research Associate at the Kavraki Lab.

Department of Computer Science - Rice University (Houston, TX). 

Imunologia molecular In silico – Parte III

 Clusterização Hierárquica e Reatividade Cruzada

A reatividade cruzada de Linfócitos T Citotóxicos (CTLs) é um fenômeno no qual uma mesma população de células CD8+ é capaz de reconhecer e responder contra dois ou mais alvos distintos (um mesmo TCR interage fortemente com mais de um complexo peptídeo:MHC). Esta característica dos CTLs tem aplicações diretas no desenvolvimento de vacinas e em outras áreas da imunologia. Conforme revisado na primeira parte deste post, houve algumas iniciativas de predição de reatividade cruzada baseadas nas sequências dos peptídeos apresentados (Frankild, 2008; De Groot, 2013), mas a compreensão e predição destes padrões de resposta têm se mostrado um desafio muito complexo.

Em um estudo publicado em 2008, uma equipe coordenada pelos pesquisadores alemães Heiner Wedemeyer e Markus Cornberg imunizou um indivíduo saudável com a vacina experimental IC41 (Fytili e cols., 2008). Esta vacina continha um epitopo imunogênico da proteína NS3 do Vírus da Hepatite C (HCV-NS3₁₀₇₃), cuja sequência de aminoácidos era “CINGVCWTV”. Conforme esperado, a vacina induziu a geração de CTLs específicos para este alvo. Em seguida, os pesquisadores recuperaram estes linfócitos e os desafiaram in vitro contra 28 variantes naturais do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, cobrindo os seis genótipos de HCV. A resposta contra a sequência selvagem “CVNGVCWT” do Genótipo 1 (G1-01), que apresenta alta reatividade cruzada com o epitopo vacinal, foi considerada o controle positivo. De acordo com os autores, foi observada uma importante reatividade cruzada com os alvos dos genótipos 4, 5 e 6, bem como com algumas variantes do genótipo 1. Por outro lado, uma fraca resposta foi observada contra os alvos dos genótipos 2 e 3. Em especial, o epitopo G3-18 (“TVGDVMWTV”) foi o único que aboliu completamente o reconhecimento pelos CTLs utilizados no ensaio (Figura 1A).

Figura 1. Comparação entre resultados in vitro e a análise estrutural in silico. (A) Resultados de um ensaio in vitro realizado por Fytili e cols., 2008, no qual uma mesma população de CTLs – específica contra a sequência selvagem do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃ - foi desafiada contra 28 variantes naturais deste alvo. (B-I) Recorte da área de interação com o TCR de alguns destes epitopos, no contexto do HLA-A*02:01, após modelagem pela técnica D1-EM-D2 (Antunes e cols., 2010). Áreas carregadas são apresentadas em azul (positivas) e vermelho (negativas), em uma escala de -10 kT a +10 kT. Complexos com forte reatividade cruzada apresentam grande semelhança estrutural (B-E), enquanto complexos com fraca resposta cruzada (F-I) apresentam diferenças no potencial eletrostático (setas verdes). Modificado de Antunes e cols., 2011.

Conforme apresentado na segunda parte deste post, o nosso grupo desenvolveu uma abordagem para a predição estrutural de complexos pMHC e começou a observar a distribuição do potencial eletrostático na superfície destes complexos. Em um trabalho publicado em 2011, foi realizada a modelagem destes 28 complexos apresentando variantes de HCV no contexto do MHC humano HLA-A*02:01 (Antunes e cols., 2011). Observando a superfície destes complexos, ficou clara a semelhança estrutural entre aqueles que apresentavam reatividade cruzada, em termos de topografia e distribuição de cargas (Figura 1B-E). Por outro lado, os complexos com fraca resposta cruzada apresentavam diferenças no potencial eletrostático, o que era especialmente visível no caso do complexo G3-18 (Figura 1I).

Na tentativa de quantificar estas relações de similaridade, nós delimitamos uma região nas imagens dos complexos e extraímos valores relativos ao histograma de cores (RGB). Estes valores foram utilizados como entrada para uma análise de componentes principais (PCA) que foi capaz de reproduzir os agrupamentos observados in vitro (Figura 2). Observe que, de acordo com o PC1 (que explica a maior parte da variabilidade dos dados), foi possível agrupar todos os complexos do genótipo 3 (G3) em um determinada faixa de valores. Os complexos do genótipo 2 ocupam outra faixa, na qual também se encontram os “mau-respondedores” do genótipo 1. Todos os complexos que apresentaram elevada reatividade cruzada se agrupam em uma faixa distinta, dominada pelos complexos do genótipo 6. Nós também incluímos nesta análise um epitopo de Influenza (IV-NA₂₃₁), cuja reatividade cruzada com o HCV-NS3₁₀₇₃ havia sido descrita previamente (Wedemeyer e cols., 2001), observando que o mesmo se localiza ao lado do epitopo selvagem de HCV.

Figura 2. Distribuição dos complexos de acordo com uma Análise de Componentes Principais (PCA). O único complexo que não apresentou resposta in vitro aparece completamente isolado (G3-18). A distribuição de acordo com o PC1 permite observar faixas que agrupam os complexos do genótipo 3 (G3), os complexos do genótipo 2 (G2) e os complexos do genótipo 6 (G6). O epitopo IV-NA₂₃₁, previamente descrito como alvo de reatividade cruzada com o epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, também se localizou junto ao grupo G6. Modificado de Antunes e cols., 2011.

        Os mesmos resultados foram observados utilizando-se outra abordagem estatística, a análise de clusterização hierárquica (HCA). O HCA também apresentava algumas vantagens práticas para a análise de um volume maior de dados, fornecendo um dendrograma das relações de similaridade entre os complexos. Foi então realizada uma triagem virtual de 55 complexos pMHC não relacionados, incluindo os pMHCs “cross-reativos” de HCV, mas também vários outros pMHCs disponíveis no CrossTope. Para esta abordagem foram utilizados valores de 7 regiões de variabilidade na superfície do pMHC (compatíveis com os footprints dos TCRs), os quais serviram para agrupar os complexos através do HCA (Antunes e cols., 2011).

Conforme esperado, o dendrograma resultante apresentou um agrupamento principal contendo as variantes de HCV. No entanto, este “cluster de HCV” incluía novos complexos. Dois deles se destacaram pela semelhança estrutural com o HCV-NS3₁₀₇₃: o HIV-GAG₇₇ (SLYNTVATL) e o EBV-LMP2₃₂₉ (LLWTLVVLL). Observe que o epitopo de EBV não compartilha nenhum aminoácido com o epitopo selvagem de HCV e que, no entanto, apresentou uma superfície muito semelhante no contexto do HLA-A*02:01. A possível reatividade cruzada entre HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉ não havia sido descrita e este alvo dificilmente teria sido sugerido por qualquer análise baseada em sequência.

Intrigados por nossa predição, o grupo do Professor Markus Cornberg resolveu testar estes alvos, utilizando estimulação ex vivo de linfócitos de pacientes HCV+ e avaliando o reconhecimento dos peptídeos através da marcação intracelular de Interferon-γ e citometria de fluxo. Estes estudos, ainda não publicados, confirmaram a reatividade cruzada entre os alvos HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉, apresentando importantes implicações para o estudo da evolução da infecção por HCV (Zhang, S., comunicação pessoal).

Encerramos assim esta jornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI). Nos próximos posts abordarei outras novidades desta nova fronteira da Imunologia, a “Imunoinformática”. Um Feliz dia dos Namorados a todos (especialmente à Stertz, L.) e boa sorte para a seleção brasileira que estreia hoje no mundial de 2014!!

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

Imunologia molecular In silico – Parte II

 A Imunoinformática Estrutural

Conforme apresentado na primeira parte deste post, em 2009 o NBLI teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates. O grupo recebeu um auxílio de U$ 100.000 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I), voltado à identificação de padrões estruturais nestes complexos. No ano seguinte, o NBLI publicou um trabalho descrevendo padrões estruturais apresentados pelos epitopos quando complexados à fenda do MHC (Antunes e cols., 2010), padrão este que não era dependente da sequência do epitopo e que era específico para cada alotipo1 de MHC (Figura 1).

Figura 1. Exemplo da sobreposição de epitopos cristalografados na fenda de MHCs murinos. As estruturas de cinco epitopos restritos a H2-D^b (1CE6, 1S7V, 1WBZ, 1ZHB e 3BUY) e cinco epitopos restritos a H2-K^b (1FO0, 1FZJ, 1LK2, 1RJY e 1S7R) foram sobrepostas. (A) Visão lateral salientando as diferenças conformacionais apresentadas por epitopos no contexto do H2-D^b (vermelho) e do H2-K^b (azul), especialmente entre as posições 5 e 7 (p5-7). (B) Visão superior. (C) Sobreposição de duas estruturas cristalográficas (1S7V e 1S7R) apresentando o mesmo epitopo (KAVYNLATM) no contexto destes dois alotipos distintos. Modificado de Antunes e cols., 2010.

   

      Este trabalho foi realizado a partir da análise de todas as estruturas de pMHCs até então determinadas experimentalmente para alguns dos alotipos de MHC de classe I mais estudados (H2-D^b, H2-K^b, HLA-A*02:01 e HLA-B*27:05), disponíveis no ProteinData Bank. Além do caráter descritivo, a identificação destes padrões permitiu o desenvolvimento de uma nova estratégia de predição de estruturas  de pMHC-I. Trabalhos recentes têm utilizado ferramentas de ancoramento molecular (docking) para a predição estrutural de complexos pMHC (Bordner, 2006; Antunes, 2010; Khan, 2010). O docking é amplamente utilizado para predizer o modo de ligação de fármacos e pequenos ligantes ao sítio ativo de enzimas e receptores proteicos, apresentando resultados rápidos e confiáveis (Morris, 2009; Trott, 2010). No entanto, sua acurácia decai rapidamente com o aumento do número de ligações flexíveis do ligante, o que aumenta o número de conformações possíveis e eleva o custo computacional para a resolução do problema (Chang e cols., 2010). Enquanto a maioria dos algoritmos disponíveis apresenta resultados confiáveis para o ancoramento molecular de ligantes com até 10 ligações flexíveis, um peptídeo típico (apresentado por MHC de classe I) possui cerca de 9 aminoácidos e pode apresentar mais de 40 ligações flexíveis. Neste contexto, a descoberta de padrões conformacionais específicos para cada alotipo de MHC viabiliza o docking de complexos pMHC-I, na medida em que permite reduzir o número de ligações flexíveis do ligante. Esta foi a premissa utilizada no desenvolvimento de uma nova estratégia de predição estrutural de complexos pMHC-I, referida como D1-EM-D2 (Figura 2).

Figura 2. Fluxograma da abordagem D1-EM-D2. A estrutura de um dado complexo pMHC-I, cuja estrutura ainda não é conhecida, pode ser modelada em três etapas: (i) Docking, (ii) Energy Minimization e (iii) Docking (D1-EM-D2). A sequência linear de aminoácidos de um peptídeo pode ser utilizada como entrada para um script do PyMOL (a), o qual gera um arquivo de coordenadas espaciais (PDB) para o epitopo alvo, ajustando a conformação da cadeia principal ao padrão “alotipo-específico”. Uma estrutura de referência contendo o alotipo de interesse é utilizada como “Doador de MHC”, removendo-se o peptídeo da fenda. O “Doador de MHC” e o “Epitopo 3D” são utilizados como entrada para o ancoramento molecular (docking) com o Autodock Vina (b), gerando um novo pMHC-I. Um ciclo de otimização da estrutura é realizado para ajustar o “Doador de MHC” ao novo epitopo. Modificado de Sinigaglia e cols., 2013.

Mesmo considerando-se apenas os genes clássicos de MHC em humanos (HLA-A, HLA-B e HLA-C)2, já são descritos mais de 8.000 alelos3, dos quais uma parcela insignificante possui estrutura conhecida. Cada um destes alelos codifica a cadeia pesada de um alotipo de MHC capaz de apresentar milhares de peptídeos, muitos dos quais seriam de grande interesse para estudos de imunologia (variantes virais, autoantígenos, epitopos que apresentam reatividade-cruzada, etc). Muitos avanços foram feitos no campo da Cristalografia de Raios-X e da Ressonância Magnética Nuclear, permitindo a determinação experimental de um número cada vez maior de estruturas proteicas. No entanto, estes métodos continuam sendo extremamente caros e demorados. Assim sendo, considerando-se a magnitude e a variabilidade deste sistema, análises estruturais em larga escala de complexos pMHC-I seriam praticamente inviáveis sem o auxílio de métodos in silico, rápidos, precisos e de baixo custo.

A abordagem D1-EM-D2 foi amplamente validada em comparação com estruturas cristalográficas, sendo então aplicada na predição em larga escala de complexos pMHC-I apresentando peptídeos imunogênicos. Estes complexos foram posteriormente disponibilizados em um banco de dados específico, o CrossTope (Sinigaglia, 2013). Juntamente com o arquivo contendo as coordenadas espaciais do complexo, o CrossTope disponibiliza informações sobre o alelo de MHC, a proteína e o organismo de origem do epitopo apresentado, etc. São fornecidos links para bancos com informações complementares, como o IEDB e o NCBI. Além disso, o banco fornece uma imagem do potencial eletrostático sobre a superfície do pMHC que fará contato com o TCR. Estudos recentes indicam que características estruturais desta superfície, como cargas e topografia, podem direcionar o reconhecimento pelos linfócitos T CD8+ (Sandalova, 2005; Antunes, 2011; Shen, 2013). De acordo com resultados in vitro, mesmo a troca de um único aminoácido pode abortar o reconhecimento por uma dada população de linfócitos (Fytili, 2008).

Figura 3. Potencial eletrostático na superfície de interação com o TCR. A imagem mostra a vista superior de três complexos pMHC formados por variantes de um mesmo epitopo (com trocas por alanina), no contexto do HLA-A*02:01. Observe a posição dos domínios α1  e α2 do MHC, entre os quais se localiza o epitopo. Regiões com cargas positivas (azuis) e negativas (vermelhas) são representadas em uma escala de -5 kT a +5 kT. As superfícies de complexos que estimulam altos níveis de IFN-gamma frente a uma população de linfócitos específica contra o tipo selvagem (CVNGVCWTV) são muito semelhantes (A e B), enquanto diferenças de topografia e cargas (setas verdes) são visíveis na superfície de um complexo que estimula fracamente a mesma população de linfócitos (C). Modificado de Antunes e cols., 2010.

Além de continuar trabalhando no aperfeiçoamento e automatização da abordagem para predição estrutural de complexos pMHC-I, nosso grupo tem especial interesse na predição de reatividade-cruzada entre epitopos virais. Na terceira e última parte deste post, serão apresentados resultados referentes ao uso de estatísticas multivariadas para a triagem virtual de complexos pMHC-I. Esta abordagem baseada em estrutura nos permitiu predizer uma reatividade-cruzada até então desconhecida, entre epitopos que não compartilhavam nenhum aminoácido em sua sequência, um resultado que já está sendo confirmado por experimentos in vitro.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).

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1 A expressão “alelos de MHC” é usualmente utilizada para referenciar tanto as variantes dos genes quanto as diferentes proteínas codificadas por estas variantes gênicas. No entanto, este segundo uso da expressão não é adequado uma vez que o termo “alelo” se refere especificamente a DNA, não a proteína. A expressão “alotipo” é indicada para referenciar as diferentes proteínas codificadas por alelos de MHC.

2 A cadeia pesada do complexo responsável pela apresentação de peptídeos endógenos na superfície celular é referida genericamente como MHC de classe I (na sigla em inglês para Major Histocompatibility Complex), mas a nomenclatura varia de acordo com a espécie. Por exemplo, em humanos ele recebe o nome HLA (na sigla em inglês para Human Leukocyte Antigen), em camundongos é referido como antígeno H2, etc.

3 Até as 14 horas de Quarta-Feira, dia 07/05/2014, havia 8.124 alelos de MHC de classe I listados no http://hla.alleles.org/nomenclature/stats.html.

Imunologia molecular In silico – Parte I

Buscando padrões em sequências virais

O Professor José Artur Bogo Chies coordena o Laboratório de Imunogenética da UFRGS, localizado no Departamento de Genética da Universidade Federal do Rio Grande do Sul, onde desenvolve pesquisas com enfoque nas análises genéticas de doenças com fundo autoimune e pró-inflamatório. Durante uma aula sobre apresentação de antígenos, para uma turma da graduação, foi surpreendido pela pergunta de um aluno sobre as características que permitiam ao sistema imune diferenciar próprio e não próprio.  Gustavo Fioravanti Vieira, então aluno do curso de Biologia, estava intrigado sobre o reconhecimento de peptídeos virais apresentados no contexto do MHC-I. Além da questão da seleção tímica e da possível influência do contexto inflamatório da infecção, haveria algum padrão nestes pequenos peptídeos apresentados pelas células infectadas que pudesse servir como uma “assinatura” típica de vírus? Afinal, as proteínas virais são formadas pelos mesmos 20 aminoácidos essenciais que formam as proteínas do hospedeiro e o linfócito CD8+ irá interagir com uma sequência de apenas 8-10 aminoácidos para “identificar” se o alvo apresentado é próprio ou não próprio. 

Figura 1. Rota de apresentação de peptídeos endógenos. Modificado de Yewdell e cols., 2003.

Muitos meses mais tarde, este despretensioso debate em sala de aula deu origem a uma nova linha de pesquisa no Laboratório de Imunogenética. O Professor José Artur convidou o ex-aluno (agora Bacharel em Biologia) para ingressar em um projeto de mestrado realizando uma análise in silico (no computador) das sequências de peptídeos virais imunogênicos. Sob co-orientação do Dr. Andrés Delgado Cañedo (Unipampa), Gustavo Vieira iniciou uma pesquisa voltada a identificação de padrões físico-químicos que pudessem ser responsáveis pelo desencadeamento de reatividade cruzada nas respostas celulares citotóxicas (Vieira & Chies, 2005). A existência de padrões físico-químicos que contribuíam para a ocorrência da reatividade cruzada entre epitopos virais foi posteriormente corroborada por experimentos realizados por pesquisadores dinamarqueses (Frankild e cols., 2008).

O projeto de Mestrado foi transformado em Tese de Doutorado e através do uso da ferramenta BLAST e de preditores das etapas da via de apresentação de antígenos endógenos foi possível identificar que os epitopos imunogênicos estavam restritos a regiões conservadas das proteínas virais (Rigo e cols., 2012). Ou seja, utilizando a proteína N dos Hantavírus como modelo de estudo, observou-se in silico que o sistema imunológico dos hospedeiros (roedores) direcionava a resposta celular contra epitopos compartilhados entre os diversos membros da família Bunyaviridae (blocos azul escuro na Figura 2). Estas sequências, por outro lado, não compartilhavam nenhuma similaridade com sequências do hospedeiro ou mesmo com sequências de outros organismos (mesmo considerando padrões físico-químicos). Estas observações são suportadas pela comparação entre a proteína N e proteínas da ordem Rodentia (hospedeiros naturais dos hantavírus) através de um sistema de janela deslizante, bem como por uma busca de motifs utilizando a ferramenta Pattern Search (Max Planck Institute). Assim sendo, a estimulação da resposta celular por estes alvos conservados potencializa a chance de imunização heteróloga (infecção pelo vírus “A” protege contra o vírus “B”) e reduz o risco de respostas autoimunes.

Figura 2. Alinhamento da proteína de nucleocapsídeo de 34 virus da família Bunyaviridae. Os blocos  acima do alinhamento indicam a localização de epitopos descritos em murinos (azul escuro) ou humanos (azul claro). Na parte superior da imagem a identidade é indicada por um histograma de cores, no qual o verde indica 100% de identidade. Observe que os epitopos murinos (hospedeiro natural) se encontram em blocos com identidade mais alta do que aquela observada para alguns epitopos descritos em humanos. Modificado de Rigo e cols., 2012.

Neste “contexto imunológico” se desenvolveu o Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI), coordenado por Gustavo Fioravanti Vieira, agora Professor Colaborador do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular (PPGBM-UFRGS). Com o tempo, o enfoque das pesquisas do grupo voltou-se da análise de sequências para a análise de estruturas, mantendo sempre o interesse central nos mecanismos da reatividade cruzada e da imunidade heteróloga. Em 2009 o grupo teve um projeto aprovado no Grand Challenges Explorations (GCE) da fundação Bill & Melinda Gates, tendo recebido um auxílio de U$ 100.000,00 dólares para desenvolver um banco de dados de estruturas peptídeo:MHC (pMHC-I). Os resultados desta nova linha de pesquisa serão apresentados na segunda parte deste post.

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).