DockTope: Um portal gratuito e simples para a predição estrutural de complexos peptídeo-MHC

Autor: Dinler Amaral Antunes, Bacharel em Biomedicina pela UFRGS, Mestrado e Doutorado pelo PPGBM/UFRGS e pós-doutorado pela Rice University (Texas/EUA).

    O ancoramento molecular (ou docking) tem sido amplamente utilizado para predizer a estrutura de complexos proteína-ligante, tanto na academia quanto na indústria [1]. Existe uma grande diversidade de programas, oferecendo recursos para abordar diferentes problemas e diferentes níveis de flexibilidade do sistema [2]. Na imunologia, uma das mais interessantes aplicações do docking diz respeito a predição de complexos peptideo-MHC de classe I (pMHC-I) [3,4], um componente central para a resposta imunológica celular. Esta aplicação, no entanto, não é trivial.

    Para predizer a conformação mais provável de um ligante na fenda do receptor o programa de docking deve explorar todas as ligações flexíveis do ligante, bem como movimentos de rotação e translação. Na maioria dos casos o docking é aplicado para ligantes pequenos (até 10 ligações flexíveis), sendo que a acurácia e a performance das predições decai com o aumento da flexibilidade do ligante [5,6]. Ligantes peptídicos representam um desafio particular para o docking, uma vez que apresentam uma cadeia principal bastante flexível e cadeias laterais que podem também adotar uma diversidade de conformações. Um estudo recente salientou a limitação dos protocolos convencionais na predição estrutural de ligantes peptídicos com até 5 resíduos [7]. Estes dados salientam o enorme desafio referente a aplicação de ferramentas de docking à moléculas de MHC de classe I, uma vez que os ligantes envolvidos são peptídeos contendo entre 8 e 11 resíduos e mais de 35 ligações flexíveis.

    Tendo em vista a importância da análise estrutural de complexos pMHC-I e as limitações dos métodos experimentais para a resolução destas estruturas (sobretudo considerando-se a grande variabilidade deste sistema), diversas abordagens foram propostas para tentar viabilizar a predição estrutural in silico de complexos pMHC-I. Dentre os exemplos mais notáveis, eu saliento o trabalho pioneiro de Andrew Bordner [3,9], bem como as ferramentas DynaPred, MHCsim e pDOCK. Apesar de apresentarem sucesso em casos particulares, estas ferramentas possuem limitações importantes e na maioria dos casos envolvem o uso de diferentes softwares e até mesmo pacotes pagos. O único desta lista que foi disponibilizado na forma de um servidor online foi o MHCsim, que na verdade não realiza a predição por docking, mas apenas converte uma estrutura conhecida (cristal) no complexo de interesse ("mutando" as posições discordantes).

    Em 2010, um grupo da UFRGS publicou um protocolo para a predição estrutural de complexos pMHC-I combinando etapas de docking e minimização de energia [10]. O protocolo foi explicado em um post anterior aqui do blog. Assim como os métodos descritos anteriormente, este protocolo envolve uso de diferentes programas e uma série de etapas de preparação e conversão de arquivos, dificultando seu uso por outros pesquisadores. No entanto, um esforço foi feito para automatizar todas as etapas e implementar o protocolo em um servidor que pudesse ser acessado livremente, sem exigir do usuário qualquer conhecimento de bioinformática. Assim surgiu o DockTope, a nova alternativa para a predição estrutural de complexos pMHC-I. Basta escolher o alelo de MHC de interesse, fornecer a sequência do peptídeo e aguardar o resultado. A técnica depende da utilização de padrões estruturais compartilhados entre peptídeos apresentados por um mesmo alelo de MHC, os quais foram determinados para 4 alelos de MHC até o momento [10]. Apesar de existirem exceções a estes padrões, um artigo publicado recentemente na Scientific Reports demonstrou a robustez do método [4]. A técnica foi empregada na reprodução de 135 estruturas cristalográficas de complexos pMHC-I (não redundantes), apresentando um valor médio de RMSD para todos os átomos do ligante inferior a 2 Å (abaixo da resolução média dos cristais utilizados, Figura 1).

Figura 1. Valores médios de RMSD (Root Mean Square Deviation)
 para as 135 estruturas cristalográficas reproduzidas, considerando-se
carbono alfa (azul) ou todos os átomos do ligante (vermelho). Valores
médios de resolução dos cristais reproduzidos também são
apresentados (verde) para comparação.

    Além do sucesso na reprodução de estruturas cristalográficas, predições baseadas nos modelos gerados foram confirmadas com dados experimentais [11,12,13]. Com base na similaridade estrutural dos modelos de complexos pMHC-I foi possível predizer eventos de reatividade cruzada de linfócitos T, envolvendo peptídeos de diferentes vírus e com baixa similaridade de sequencia [13]. Estes dados reforçam a validade biológica dos modelos gerados, salientando a aplicabilidade deste método para o desenvolvimento de vacinas.

   O DockTope já está sendo aplicado em larga escala para modelar uma série de alvos (principalmente peptídeos virais) os quais estão sendo depositados em um banco de dados desenvolvido pela mesma equipe, o CrossTope [14]. Neste site o usuário pode pesquisar os complexos que já foram modelados e obter informações sobre o receptor e o ligante, bem como links para outros bancos de dados. Também é possível comparar complexos de interesse e observar o potencial eletrostático da superfície de interação com o TCR. Apesar de possibilitar a modelagem de um número restrito de alelos de MHC, o DockTope inclui justamente alelos de elevado interesse para os imunologistas. O HLA-A*02:01 é um dos mais frequentes alelos em humanos [15] e o alelo HLA-B*27:05 foi associado ao controle da infecção por HIV e HCV [16,17,18], bem como a eventos de autoimunidade (ex.: espondilite anquilosante) [19].

Limitações: Conforme mencionado anteriormente, já foram identificados alguns exemplos de exceções aos padrões utilizados para modelar a cadeia principal dos peptídeos [10]. Até o momento não é possível identificar com base na sequência se o alvo de interesse será uma destas exceções, então existe um erro associado a técnica. Este tipo de incerteza é comum a qualquer método de predição e os dados de reprodução de cristais mencionados anteriormente reforçam a ideia de que a técnica é bem sucedida na maioria dos casos, pelo menos para estes alelos (HLA-A*02:01, HLA-B*27:05, H2-Db, H2-Kb). É possível observar na Figura 1 que a média de RMSD das reproduções para HLA-B*27:05 foi mais alta que para os demais alelos, o que salienta a complexidade associada a flexibilidade do ligante. Peptídeos restritos a este alelo apresentam um conteúdo maior de argininas, as quais possuem longas cadeias laterais, sendo particularmente difíceis de predizer com acurácia. Nesta primeira fase, o DockTope não permite que o usuário modele múltiplos alvos ao mesmo tempo, o que dificulta a modelagem de um conjunto grande de complexos. Estas restrições devem ser flexibilizadas em um segundo momento, a medida que for confirmada a demanda pelo serviço. 

Um novo tipo de célula T supressora regula outras células T competindo por ligantes self-MHC subliminares

 
Devido à imprevisibilidade dos contatos antigênicos futuros, é crucial para o sistema imune manter um repertório variado de linfócitos T, apesar da idade e das repetidas expansões clonais provocadas por infecções. Como o repertório contrai após uma expansão é um processo ainda mal compreendido. Por exemplo, se a restauração dos números de células T fosse regulada apenas por competição por fatores de sobrevivência e/ou crescimento, deveríamos esperar uma perda gradual de clones de células T “bystander”, e uma redução progressiva do repertório em função do tempo, o que não acontece. Além disso, a importância da presença de clones não relacionados para o destino de um clone é grande. Em modelos experimentais, os clones autorreativos só se comportam de forma agressiva, quando estão em ambiente linfopênico, mas os mecanismos regulatórios exercidos por outros clones não estão totalmente esclarecidos.

Um trabalho recente de Singh e colaboradores identificou um novo tipo de célula T supressora para células T CD4, que recapitula a seleção positiva no timo, e ajuda a preservar a variabilidade clonal através de competição entre clones não relacionados de células T (Singh, NJ, Bando, JK, e Schwartz, RH. 2012. Subsets of nonclonal neighboring CD4+ T cells specifically regulate the frequency of individual antigen-reactive T cells. Immunity 37; 735-746).

Singh e colaboradores estabeleceram um modelo em que células T CD4 transgênicas 5C.C7, específicas para o citocromo c de pombo eram transferidas para animais transgênicos que expressavam o citocromo c mas, como esperado, só causavam autoimunidade em recipientes linfopênicos. A mistura do clone 5C.C7 com células T policlonais normais inibia o aparecimento de autoimunidade. Como identificar a célula T normal que interferia com o clone ? Os autores então dividiram o “pool” de linfócitos T normais em subpopulações de 100 células, e mostraram que alguns destes pools, mas não outros, deletavam as células 5C.C7autoimunes. Importante, a atividade deletadora não tinha qualquer relação com a expressão de marcadores de células Treg. Um pool que fosse supressor para o clone 5C.C7, no entanto, não deletava a atividade de um clone específico para outro antígeno. Além disso, o pool não tinha especificidade para citocromo, mas era capaz de deletar o clone 5C.C7 também em interações singênicas, na ausência do antígeno exógeno.

Como resultado de muito esforço, Singh et al. sequenciaram os TCRs do pool celular deletador. A partir de um TCR identificado, criaram um camundongo transgênico expressando o TCR capaz de deletar o clone 5C.C7 em culturas, indicando que este novo TCR clonado era responsável pela atividade deletadora do pool. A co-transferência in vivo para animais linfopênicos mostrou que este novo clone de célula T CD4 era um potente supressor da atividade autoimune do clone 5C.C7.        

Um trabalho anterior havia identificado um peptídeo endógeno, expresso em diferentes tecidos, inclusive no timo, e que era capaz de mediar a seleção positiva do TCR expresso pelo clone 5C.C7 (Ebert PJ et al., 2009, Nat. Immunol. 10; 1162-1169). Singh e colaboradores mostraram que a nova célula T supressora, assim como o clone 5C.C7, reconhecia exatamente este mesmo peptídeo endógeno. Os autores denominaram o peptídeo de ligante subliminar, porque não levou a respostas flagrantes, mas sim a sinais de sobrevivência. Quando o clone 5C.C7 e o novo clone deletador eram misturados, eles competiram diretamente por este peptídeo, até que as células deletadoras ganharam. Os autores propuseram que o pool periférico de linfócitos T pode ser subdividido em “colônias” discretas, contendo clones não relacionados, que têm em comum a reação cruzada por um peptídeo endógeno complexado a MHC, que é um ligante subliminar que permite liberação de sinais de sobrevivência (Figura 1). Desta forma, a regulação da contração clonal ocorre dentro de uma determinada colônia, e não se alastra por todo o repertório. Esta fragmentação da atividade regulatória pode ser um mecanismo crucial para manter a estabilidade e a variabilidade do repertório ao longo do tempo. Uma questão interessante é se as APCs deste sistema seriam células dendríticas e macrófagos, ou se seriam células epiteliais, como ocorre no timo. Este trabalho mostra a importância da autorreatividade intrínseca dos TCRs e revela a existência de um potente mecanismo de regulação periférica: uma célula T supressora independente de células Treg, baseada em competição por um ligante antigênico do próprio hospedeiro. Estudos futuros deverão avaliar a relevância deste mecanismo regulatório em situações de inflamação e autoimunidade.

 

 

Figura 1. A figura mostra o repertório de células T subdividido por diferentes colônias. Uma colônia contem múltiplos clones, que reconhecem diferentes antígenos exógenos, mas estes clones fazem reação cruzada com um ligante subliminar, que fornece sinais de sobrevivência. O clone deletador de cada colônia é aquele que possui a maior afinidade pelo ligante subliminar; é este que vai determinar a contração de um clone competidor após uma expansão clonal provocada por uma infecção (representado interagindo com o ligante subliminar).

(figura retirada do comentário editorial de: Walker, LSK, Immunity 37; 598-600, 2012)

 

Post de George A. DosReis

Imunologia no tempo dos Beatles: a descoberta do processamento e apresentação de antígenos

Depois das primeiras descobertas de Metchnikov, a Imunologia Celular foi esquecida e sòmente renasceu na era dos Beatles, nos anos 60. Alguns marcos desta nova ciência foram: a descoberta da importância do timo (Miller, JF. The thymus and the development of immunologic responsiveness. Science 144; 1544-1551, 1964); e a descoberta do isoantígeno theta (CD90) como marcador de linfócitos T (Raff, MC. Theta isoantigen as a marker of thymus-derived lymphocytes in mice. Nature 224; 378-379, 1969).

O nascimento desta nova disciplina não foi tranquilo; seus entusiastas tiveram que lutar contra preconceitos e dogmas estabelecidos pela imunologia dominante até então, que era influenciada pela microbiologia, pela imunoquímica e pela imunopatologia. Como seria a vida daqueles pioneiros da imunologia celular ? Trabalharam quase no escuro, e com a informação obtida, acertaram muito mais do que erraram, para que a imunologia chegasse aonde está hoje. A imunologia celular pioneira parecia com os Beatles: surpreendendo, quebrando barreiras, e parafraseando George Harrison: “salvando a imunologia da chatice”.

Nos anos 60, o Scripps Research Institute, de San Diego, uma das mais conceituadas instituições de pesquisa em imunologia dos USA, foi fundado e dirigido por Frank Dixon, um imunopatologista já falecido, famoso por seus estudos sobre glomerulonefrites provocadas por complexos antígeno-anticorpo. Frank Dixon reuniu na clínica Scripps um grupo de excelentes pesquisadores que deram grandes contribuições à imunopatologia. Isto se deu porque foram capazes de quantificar o efeito lesivo dos anticorpos em tecidos animais, e de localizar os anticorpos por meio de técnicas pioneiras de marcação radioativa.

Eu evito confundir admiração científica com admiração pessoal, ou com as posições políticas de pesquisadores, pois as decepções são frequentes. Mas este é um caso representativo do pioneirismo dos anos 60. É a história do que aconteceu com o imunologista Emil Unanue que, nos anos 60 viajou para a Inglaterra, e lá descobriu que macrófagos processam e apresentam antígenos para linfócitos. Num relato recente, Emil Unanue descreve os dois momentos distintos que viveu na Clínica Scripps (Unanue, ER. Starting in immunology by way of immunopathology. Annu. Rev. Pathol. 6; 1-18, 2011). Unanue foi recrutado para este grupo e foi acolhido por Frank Dixon, que era um líder de posições firmes e decidido. Neste início, Unanue deu várias contribuições importantes ao tema de inflamação mediada por anticorpos e o papel de neutrófilos neste processo.          

Em 1966, Unanue foi para o NIMR, Mill Hill, Londres, para ampliar a sua formação. Lá, interagindo com os imunologistas ingleses, ele mudou a sua forma de pensar sobre imunologia. Trabalhando junto com Brigitte Askonas, ele demonstrou que a imunogenicidade de proteínas podia ser aumentada se estas estivessem associadas a macrófagos vivos (Unanue ER, Askonas BA. The imune response of mice to antigen in macrophages. Immunology 15; 287-296, 1968). Este trabalho é um clássico, o primeiro que sugere a existência de processamento e apresentação de antígenos para linfócitos. Retornando à Scripps, Unanue se associou com Jean-Charles Cerottini (um pesquisador visitante europeu que depois desenvolveu o método da marcação pelo Cromo, possibilitando estudar a citotoxicidade). Utilizando marcação radioativa, eles encontraram uma fração do antígeno proteico que ficava associada a macrófagos por longos períodos (J Exp Med 151; 711-725, 1970). Na Scripps, a pesquisa imunológica continuava centralizada nos anticorpos, no complemento e nos neutrófilos, e aqueles resultados com macrófagos eram vistos com incredulidade. O resultado era robusto – oferecer proteínas a macrófagos sempre as tornava melhores antígenos – mas ia contra o dogma de que macrófagos, através de lisossomas, catabolizavam e destruíam as proteinas. Por isso, o esforço de Unanue e Cerottini era o de encontrar no macrófago um compartimento aonde o antígeno ficasse protegido da destruição. As ferramentas bioquímicas e de biologia celular eram precárias, mas os traçadores radioativos confirmavam a existência de um pequeno pool estável de antígeno.

Quando indagado sobre imunidade celular, Frank Dixon era muito reticente e crítico. Comparando com os seus anticorpos nefrotóxicos, dizia que não se pode acreditar naquilo que não pode ser quantificado. Frank Dixon não acreditou e não aceitou as idéias de Unanue, e a relação entre eles se tornou quase hostil, a ponto de Unanue decidir ir embora. Naquele momento, Unanue conheceu Baruj Benacerraf, e lhe contou sobre suas dificuldades. Ficaram amigos aparentemente porque podiam relembrar juntos a língua espanhola. Unanue é cubano e Benacerraf.já falecido, era venezuelano. Benacerraf acreditava na importância de anticorpos citofílicos, uma forma de fundir a velha e a nova imunologias. Os resultados de Unanue poderiam ajudar nesta hipótese, que no entanto, não vingou. Pouco depois, Benacerraf convidou Unanue para ir com ele para a Faculdade de Medicina de Harvard. O conceito de apresentação de antígenos se espalhou como um vírus. Foi neste ambiente que, nos anos que se seguiram, Emil Unanue caracterizou o processamento de antígenos e as interações entre peptídeos e moléculas de MHC (Unanue, ER. From antigen processing to peptide-MHC binding. Nat. Immunol. 7; 1277-1279, 2006).

As interações sociais afetam a evolução da ciência. A vaidade, em particular, é uma característica digna de nota pela sua frequência. Nenhuma disputa científica se passa apenas ao nível das idéias. Deixa ressentimentos, faz inimigos, azeda sonhos. Por outro lado, as disputas e rupturas sociais na ciência têm um papel de fomento, pois separam os rivais, contribuindo para diversificar as idéias científicas e nuclear novos grupos de pesquisa.    

Post de George A. DosReis

IBCCF-UFRJ

Apresentação de antígenos lipídicos por moléculas CD1: novas perspectivas sobre o reconhecimento do próprio e não-próprio

Fonte: Marco Colonna. Skin function for human CD1a-reactive T cells. Nature Immunology 2010, vol. 11, n. 12, pag. 1079-1080.


Por Kelly Grace Magalhães

A descoberta da apresentação de antígenos por moléculas CD1 mudou a visão geral dos imunologistas sobre o papel dos linfócitos T, através da demonstração de que linfócitos T reconhecem não apenas peptídeos, mas também antígenos lipídicos. O primeiro registro desse achado foi feito em 1994 pelo grupo do Dr. Michael Brenner (Brigham and Women’s Hospital - Harvard Medical School), que demonstrou que lipídeos micobacterianos poderiam ser reconhecidos por linfócitos T αβ. Desde então diversos trabalhos vem documentando a apresentação e o reconhecimento de diferentes lipídeos, glicolipídios ou mesmo lipopeptídeos aos linfócitos T.

Surpreendentemente, uma fração significativa do nosso repertório normal de linfócitos T provenientes de sangue periférico humano são autoreativos ao grupo 1 da família de proteínas CD1. Esse foi o interessante achado do grupo do Dr. David Branch Moody (Brigham and Women’s Hospital - Harvard Medical School), publicado na Nature Immunology (Dec 2010, vol. 11, n. 12, pag.1102-1109), que demonstrou que linfócitos T respondem à CD1a, uma molécula apresentadora de antígenos lipídicos expressa na superfície de células de Langehans na pele humana, entre outras células. Esses resultados mostraram pela primeira vez que moléculas CD1 são capazes de apresentar lipídeos endógenos aos linfócitos T αβ e induzir secreção de IL-22, uma citocina capaz de estimular a liberação de peptídeos antimicrobianos bem como a sobrevivência e proliferação de queratinócitos. Estes autores desenvolveram um interessante ensaio que dispensava o uso de tetrâmeros CD1-lipídeos. Eles desafiaram linfócitos T com uma linhagem celular (K562) transfectada com genes que codificam CD1a, CD1b e CD1c. As células K562 não são apresentadoras de antígeno profissionais, não expressam o complexo maior de histocompatibilidade (MHC) classe II, mas apenas baixos níveis de MHC classe I. Isso permitiu a estimulação de linfócitos T de maneira independente de MHC sem a indução de linfócitos T aloreativos. Com esse ensaio, eles descobriram que todos os doadores testados possuíam, inesperadamente, uma alta freqüência de linfócitos T que responderam às células K562 transfectadas com o gene que codifica CD1a, mas em contraste, poucos doadores tinham linfócitos T restritos à CD1b ou CD1c.

Em outro interessante estudo, o grupo da Dra. Giulia Casorati (San Raffaele Scientific Institute) publicado na European Journal of Immunology (Mar 2011, vol. 41, pag. 602-610), comparou clones de linfócitos T provenientes de cordão umbilical e de sangue periférico de adultos. Estes autores estimaram que de cada 10 a 300 linfócitos T circulantes, 1 era autoreativo ao grupo 1 da família de proteínas CD1, uma freqüência comparável ao de linfócitos T aloreativos ao MHC. Além disso, o grupo da Dra. Casorati observou que linfócitos T autoreativos ao CD1 estão presentes em freqüências comparáveis, tanto em adultos quanto no cordão umbilical.

Portanto, tem se tornado cada vez mais claro que linfócitos T autoreativos, restritos à CD1, constituem uma porção muito mais significativa do que se pensava anteriormente, e devem desempenhar um papel distinto e não-convencional no sistema imunológico. Além disso, o estudo de linfócitos T que reconhecem lipídeos endógenos apresentados por moléculas CD1a é de especial importância no melhor entendimento dos mecanismos de doenças autoimunes da pele, como dermatite atópica e psoríases, e pode auxiliar na identificação de potenciais alvos de intervenção terapêutica.

Para quem quiser se aprofundar no assunto segue uma lista com alguns ótimos artigos da área:

de jong, A., Pena-Cruz, V., Cheng, T.-Y., Clark, R. A., Van Rhijn, I. and Moody, D. B., CD1a-autoreactive T cells are normal component of the human αβ T cell repertoire. Nat. Immunol. 2010. 12: 1102–1109.

Colonna M. Skin function for human CD1a-reactive T cells. Nat Immunol. 2010. 12:1079-80.

Young MH & Gapin L. Group 1 CD1-restricted T cells take center stage. Eur. J. Immunol. 2011. 41: 602–610

de Lalla, C., Lepore, M., Piccolo, F. M., Rinaldi, A., Scelfo, A., Garavaglia, C., Mori, L. et al., High frequency and adaptative-like dynamics of human CD1 self-reactive T cells. Eur. J. Immunol. 2011. 41: 602–610.

Barral, D. C. and Brenner, M. B., CD1 antigen presentation: how it works. Nat. Rev. Immunol. 2007. 7: 929–941.

De Libero, G. and Mori, L., Recognition of lipid antigens by T cells. Nat. Rev. Immunol. 2005. 5: 485–496.

Beckman, E. M., Porcelli, S. A., Morita, C. T., Behar, S. M., Furlong, S. T. and Brenner, M. B., Recognition of a lipid antigen by CD1-restricted ab T cells. Nature 1994. 372: 691–694.