DockTope: Um portal gratuito e simples para a predição estrutural de complexos peptídeo-MHC

Autor: Dinler Amaral Antunes, Bacharel em Biomedicina pela UFRGS, Mestrado e Doutorado pelo PPGBM/UFRGS e pós-doutorado pela Rice University (Texas/EUA).

    O ancoramento molecular (ou docking) tem sido amplamente utilizado para predizer a estrutura de complexos proteína-ligante, tanto na academia quanto na indústria [1]. Existe uma grande diversidade de programas, oferecendo recursos para abordar diferentes problemas e diferentes níveis de flexibilidade do sistema [2]. Na imunologia, uma das mais interessantes aplicações do docking diz respeito a predição de complexos peptideo-MHC de classe I (pMHC-I) [3,4], um componente central para a resposta imunológica celular. Esta aplicação, no entanto, não é trivial.

    Para predizer a conformação mais provável de um ligante na fenda do receptor o programa de docking deve explorar todas as ligações flexíveis do ligante, bem como movimentos de rotação e translação. Na maioria dos casos o docking é aplicado para ligantes pequenos (até 10 ligações flexíveis), sendo que a acurácia e a performance das predições decai com o aumento da flexibilidade do ligante [5,6]. Ligantes peptídicos representam um desafio particular para o docking, uma vez que apresentam uma cadeia principal bastante flexível e cadeias laterais que podem também adotar uma diversidade de conformações. Um estudo recente salientou a limitação dos protocolos convencionais na predição estrutural de ligantes peptídicos com até 5 resíduos [7]. Estes dados salientam o enorme desafio referente a aplicação de ferramentas de docking à moléculas de MHC de classe I, uma vez que os ligantes envolvidos são peptídeos contendo entre 8 e 11 resíduos e mais de 35 ligações flexíveis.

    Tendo em vista a importância da análise estrutural de complexos pMHC-I e as limitações dos métodos experimentais para a resolução destas estruturas (sobretudo considerando-se a grande variabilidade deste sistema), diversas abordagens foram propostas para tentar viabilizar a predição estrutural in silico de complexos pMHC-I. Dentre os exemplos mais notáveis, eu saliento o trabalho pioneiro de Andrew Bordner [3,9], bem como as ferramentas DynaPred, MHCsim e pDOCK. Apesar de apresentarem sucesso em casos particulares, estas ferramentas possuem limitações importantes e na maioria dos casos envolvem o uso de diferentes softwares e até mesmo pacotes pagos. O único desta lista que foi disponibilizado na forma de um servidor online foi o MHCsim, que na verdade não realiza a predição por docking, mas apenas converte uma estrutura conhecida (cristal) no complexo de interesse ("mutando" as posições discordantes).

    Em 2010, um grupo da UFRGS publicou um protocolo para a predição estrutural de complexos pMHC-I combinando etapas de docking e minimização de energia [10]. O protocolo foi explicado em um post anterior aqui do blog. Assim como os métodos descritos anteriormente, este protocolo envolve uso de diferentes programas e uma série de etapas de preparação e conversão de arquivos, dificultando seu uso por outros pesquisadores. No entanto, um esforço foi feito para automatizar todas as etapas e implementar o protocolo em um servidor que pudesse ser acessado livremente, sem exigir do usuário qualquer conhecimento de bioinformática. Assim surgiu o DockTope, a nova alternativa para a predição estrutural de complexos pMHC-I. Basta escolher o alelo de MHC de interesse, fornecer a sequência do peptídeo e aguardar o resultado. A técnica depende da utilização de padrões estruturais compartilhados entre peptídeos apresentados por um mesmo alelo de MHC, os quais foram determinados para 4 alelos de MHC até o momento [10]. Apesar de existirem exceções a estes padrões, um artigo publicado recentemente na Scientific Reports demonstrou a robustez do método [4]. A técnica foi empregada na reprodução de 135 estruturas cristalográficas de complexos pMHC-I (não redundantes), apresentando um valor médio de RMSD para todos os átomos do ligante inferior a 2 Å (abaixo da resolução média dos cristais utilizados, Figura 1).

Figura 1. Valores médios de RMSD (Root Mean Square Deviation)
 para as 135 estruturas cristalográficas reproduzidas, considerando-se
carbono alfa (azul) ou todos os átomos do ligante (vermelho). Valores
médios de resolução dos cristais reproduzidos também são
apresentados (verde) para comparação.

    Além do sucesso na reprodução de estruturas cristalográficas, predições baseadas nos modelos gerados foram confirmadas com dados experimentais [11,12,13]. Com base na similaridade estrutural dos modelos de complexos pMHC-I foi possível predizer eventos de reatividade cruzada de linfócitos T, envolvendo peptídeos de diferentes vírus e com baixa similaridade de sequencia [13]. Estes dados reforçam a validade biológica dos modelos gerados, salientando a aplicabilidade deste método para o desenvolvimento de vacinas.

   O DockTope já está sendo aplicado em larga escala para modelar uma série de alvos (principalmente peptídeos virais) os quais estão sendo depositados em um banco de dados desenvolvido pela mesma equipe, o CrossTope [14]. Neste site o usuário pode pesquisar os complexos que já foram modelados e obter informações sobre o receptor e o ligante, bem como links para outros bancos de dados. Também é possível comparar complexos de interesse e observar o potencial eletrostático da superfície de interação com o TCR. Apesar de possibilitar a modelagem de um número restrito de alelos de MHC, o DockTope inclui justamente alelos de elevado interesse para os imunologistas. O HLA-A*02:01 é um dos mais frequentes alelos em humanos [15] e o alelo HLA-B*27:05 foi associado ao controle da infecção por HIV e HCV [16,17,18], bem como a eventos de autoimunidade (ex.: espondilite anquilosante) [19].

Limitações: Conforme mencionado anteriormente, já foram identificados alguns exemplos de exceções aos padrões utilizados para modelar a cadeia principal dos peptídeos [10]. Até o momento não é possível identificar com base na sequência se o alvo de interesse será uma destas exceções, então existe um erro associado a técnica. Este tipo de incerteza é comum a qualquer método de predição e os dados de reprodução de cristais mencionados anteriormente reforçam a ideia de que a técnica é bem sucedida na maioria dos casos, pelo menos para estes alelos (HLA-A*02:01, HLA-B*27:05, H2-Db, H2-Kb). É possível observar na Figura 1 que a média de RMSD das reproduções para HLA-B*27:05 foi mais alta que para os demais alelos, o que salienta a complexidade associada a flexibilidade do ligante. Peptídeos restritos a este alelo apresentam um conteúdo maior de argininas, as quais possuem longas cadeias laterais, sendo particularmente difíceis de predizer com acurácia. Nesta primeira fase, o DockTope não permite que o usuário modele múltiplos alvos ao mesmo tempo, o que dificulta a modelagem de um conjunto grande de complexos. Estas restrições devem ser flexibilizadas em um segundo momento, a medida que for confirmada a demanda pelo serviço. 

Estratégias para explorar a flexibilidade do receptor durante o docking.

Autor: Dinler Antunes, pós-doutorando no Departamento de Ciências da Computação da Rice University, no Texas/EUA.

    As proteínas são os principais efetores da informação genômica e suas funções são usualmente influenciadas pela interação com outras moléculas. Descrever e compreender tais interações nos permite planejar formas de interagir com estes sistemas, sobretudo através do uso de pequenos ligantes (fármacos ou peptídeos); os quais podem estimular ou inibir rotas de interesse.

Figura 1. Modelos de reconhecimento biomolecular. Chen YC, 2015. 

  Do ponto de vista teórico, nossa compreensão sobre os mecanismos de interação molecular evoluiu do revolucionário (mas incompleto) modelo de "chave e fechadura", para modelos que consideram a flexibilidade estrutural das moléculas envolvidas (Figura 1). Os dois modelos de maior destaque são o (i) "Encaixe Induzido" e a (ii) "Seleção Conformacional". O primeiro, descreve uma situação na qual proteína e ligante não apresentam conformações adequadas para uma interação forte, mas se adaptam um ao outro após o contato inicial. O segundo modelo deriva da compreensão de que proteínas existem em solução como um conjunto (ensemble) de confôrmeros alternativos, cujas proporções são determinadas por efeitos termodinâmicos. O ligante, neste modelo, apresenta maior afinidade por um determinado confôrmero, de modo que a subsequente interação estabiliza esta subpopulação, aumentando sua frequência no conjunto. Apesar de usualmente retratados como modelos alternativos, os dados experimentais suportam a ideia de que ambos sejam na verdade casos particulares de um fenômeno mais abrangente (Csermely et al., 2010, Feixas et al. 2014).

   Paralelamente ao desenvolvimento de modelos teóricos, o aumento no número de estruturas proteicas determinadas por métodos experimentais fomentou o desenvolvimento de diversos métodos computacionais para auxiliar na seleção de potencias ligantes, bem como para predizer a afinidade e a estrutura do complexo formado. Uma das principais ferramentas neste contexto é o chamado ancoramento molecular (ou docking), o qual tem sido amplamente utilizado na pesquisa e na indústria, abrangendo uma grande diversidade de métodos e aplicações (Souza et al., 2013).

   A primeira vista, o desenvolvimento destes métodos parece refletir a evolução dos modelos teóricos, começando pelo uso de softwares que consideravam proteína e ligante como estruturas rígidas e evoluindo para uma diversidade de métodos que considera tanto a flexibilidade do ligante quanto a do receptor. Por exemplo, o uso de etapas de minimização do complexo após o docking com a proteína rígida parece simular o efeito de "encaixe induzido". Por outro lado, o uso de múltiplas estruturas do receptor para realizar o docking de um mesmo ligante  parece uma implementação do modelo de "Seleção conformacional". Tais associações são tão naturais que passaram a ser utilizadas como uma forma de classificar os diferentes métodos desenvolvidos. No entanto, as limitações computacionais tiveram um impacto muito maior do que os modelos teóricos no sentido de moldar a evolução dos métodos de docking, sobretudo no que se refere a inclusão da flexibilidade do receptor. Proteínas podem ter milhares de ligações flexíveis, e a exploração explicita de toda esta flexibilidade era computacionalmente inviável. Uma alternativa foi desenvolver métodos que consideravam a flexibilidade do receptor apenas de forma implícita, como através da suavização do potencial de Van-der-Waals, ou de forma explícita mas parcial, explorando por exemplo apenas alguns poucos resíduos do receptor. A rápida evolução dos computadores viabilizou o desenvolvimento de uma série de novos métodos, muitos dos quais incluem uma combinação de métodos anteriores, o que torna inviável uma classificação baseada nos modelos teóricos. 

    Em um artigo publicado recentemente, nós realizamos uma revisão atualizada dos métodos utilizados para explorar a flexibilidade da proteína durante o ancoramento molecular do ligante, sugerindo uma nova forma de classificação (Antunes et al. 2015). Ao invés de focar na semelhança com os modelos teóricos, nós agrupamos os métodos de acordo com o nível de flexibilidade do receptor efetivamente explorado durante o docking (Figura 2). O artigo também discute como a escolha do método mais adequado depende da aplicação desejada e aborda alguns dos desafios atuais no desenvolvimento de novos métodos de ancoramento molecular.

Figura 2. Nova proposta de classificação dos métodos para explorar flexibilidade do receptor durante o docking. Imagem modificada de Antunes et al., 2015. Texto completo aqui. Todos os métodos incluídos nesta classificação também exploram simultaneamente a flexibilidade do ligante, utilizando diferentes algoritmos.  Uma revisão das estratégias para explorar a flexibilidade do ligante é apresentada em Guedes et al., 2013.