Associação entre a Expressão de CD47 em Eritrócitos Jovens e Maduros, Capacidade fagocítica e Carga Parasitária na Infecção Murina pelo Plasmodium yoelii

Biotinilação in vivo separa a população de eritrócitos jovens dos maduros com níveis diferenciais de expressão de CD47. (A) As três dosagens de biotina nos dias consecutivos ao desafio recobrem todos os eritrócitos em camundongos selvagens C57BL/6, antes de desafiá-los com o Plasmodium yoelii, contendo a proteína GFP (GFP-PyNL). Inicialmente, os eritrócitos são 100% positivos, após marcação in vitro com estreptatividina-APC. Gradualmente, o acúmulo de eritrócitos jovens (diagrama de fluxo representativo no retângulo inferior) é observado com a perda da população de eritrócitos maduros (diagrama de fluxo representativo no retângulo superior); d= dias após infecção. (B) A média ± erro padrão do percentual de eritrócitos jovens e maduros durante o curso da infecção estão plotados no gráfico da direita. Fonte: Banerjee et al., março 2015. PNAS.

Espécies de Plasmodium exibem uma forte preferência por infectar eritrócitos jovens, o que pode vir a ser um dos determinantes principais da gravidade da malária e sua patogênese. A base molecular que fundamenta essa preferência e a sua influência na carga parasitária ainda não está completamente elucidada.

Em trabalho recente publicado no PNAS, o qrupo de pesquisa liderado pelo Dr. Sanjai Kumar do Laboratory of Emerging Pathogens, Center for Evaluation and Biologics Research, FDA nos Estados Unidos, abordou a associação entre infecção por Plasmodium x carga parasitária x idade dos eritrócitos, considerando-se como proteína-alvo o CD47. Essa proteína está presente na maioria das células, incluindo eritrócitos, e em conjunto com a proteína alfa reguladora de sinal expressa em macrófagos, previne o clareamento das células pelo sistema imune.

No estudo foi investigado o papel de CD47 no crescimento e sobrevivência de Plasmodium yoelli 17XNL em camundongos C57BL/6 (PyNL). Utilizando parasitos expressando GFP, os pesquisadores demonstraram que eles preferencialmente infectam eritrócitos jovens altamente positivos para CD47. Além disso, camundongos deficientes em CD47 foram resistentes à infecção por PyNL e apresentaram picos de parasitemia 9,3 vezes menor do que os camundongos selvagens. Durante a fase aguda da infecção, essa resistência aumentada à malária observada nos camundongos deficientes de CD47 estava associada à elevação da frequência de células esplênicas F4/80+ que, por sua vez, apresentavam frequência maior de fagocitose de eritrócitos parasitados em comparação às células de camundongos selvagens. Adicionalmente, a injeção de anticorpos neutralizantes para CD47 induziu uma redução significativa na carga parasitária em camundongos selvagens.

Esses resultados sugerem que eritrócitos jovens que expressam alta densidade de CD47 servem como um escudo para o Plasmodium, protegendo-o da eliminação pelas células fagocíticas. Esse pode ser um dos mecanismos de escape utilizados pelo Plasmodium que preferencialmente infecta eritrócitos jovens. Modulação dos níveis de CD47 com o uso de anticorpos anti-CD47 poderá futuramente ser uma alternativa terapêutica empregada em pacientes com malária grave.

Referência:

Banerjee R, Khandelwal S, Kozakai Y, Sahu B, Kumar S. CD47 regulates the phagocytic clearance and replication of the Plasmodium yoelii malaria parasite. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 10;112(10):3062-7. doi: 10.1073/pnas.1418144112.

Postagem extra: Patarroyo e as vacinas

Pai de vacina sintética contra malária lamenta falta de apoio à ciência

Fonte: Folha de São Paulo - 31/05/2011 16:25

O colombiano Manuel Elkin Patarroyo, que criou a primeira vacina sintética contra a malária, lamentou nesta segunda-feira "a ausência" de políticas de Estado para impulsionar a ciência na América Latina.

"Ficamos 40 anos movimentando a ciência na Colômbia. Quarenta anos! Comecei muito cedo, mobilizando o país inteiro: 'Olhe, a ciência é útil, é produtiva, não é uma questão de loucos. Isto é algo que realmente conta para a humanidade, para o país, para as pessoas'", relatou.

"Eu não digo que seja indiferença, eu diria que é ausência de políticas de Estado para impulsionar a ciência", avaliou o pesquisador em entrevista à Agência Efe em Madri.

Nesta terça-feira, ele receberá o prêmio Príncipe de Viana da Solidariedade em Navarra, no norte da Espanha.

"Na América Latina, há dois países que se sobressaem, que são México e Brasil, e só", lamentou Patarroyo, que acaba de apresentar a descoberta de princípios químicos a partir dos quais é possível criar vacinas sintéticas contra praticamente todas as 517 doenças infecciosas conhecidas.

A descoberta, "resultado de 33 anos de trabalho", são "regras de jogo definidas" que servirão para prevenir doenças, entre elas a malária, a tuberculose, a hepatite e a dengue, que causam milhões de mortes no mundo.

VACINAS EM DESENVOLVIMENTO

O cientista trabalha agora na segunda geração desta vacina, denominada Colfavac, que deve começar a ser testada em junho de 2012 em humanos, após obter "pouco mais de 90%" de proteção em macacos, o "mesmo resultado" que Patarroyo acredita que obterão em homens e mulheres.

"Nós não estamos pulando do rato ou do coelho aos humanos. Estamos pulando de um único animal, que tem um sistema de defesa praticamente idêntico ao humano, ao humano", explicou.

O cientista revelou que não vai ceder sua nova vacina contra malária à OMS (Organização Mundial da Saúde), como fez com a primeira, "porque a OMS a arquivou, simples e ingenuamente".

Ele afirmou que conta com o apoio de um grupo de pessoas que "está querendo criar um consórcio para produzir a vacina e entregá-la de graça ou a baixo custo à humanidade".

Os testes da nova vacina demandarão "de dois a três anos", o que proporcionará tempo para que trabalhe em outras vacinas.

"Já estamos trabalhando fortemente em tuberculose. É a próxima", relatou Patarroyo, que, apesar das conquistas alcançadas, destacou que "há muito" por fazer até que "se consiga vacinar todas as pessoas".

Malária francamente brasileira

É difícil estudar malária no Brasil. A infecção pelo plasmódio está quase que completamente restrita ao território conhecido como Amazônia legal, que integra estados brasileiros da região indicada no mapinha mostrado abaixo.

A maioria dos casos detectados em nosso território são causados pelo Plasmodium vivax, mas também temos P. falciparum e alguns casos de P. malariae. São vários os grupos que estudam aspectos epidemiológicos, clínicos, sociais, econômicos, culturais, e outros tantos estudam a imunologia da malária no Brasil. Eu tive a oportunidade de passar pela experiência de tentar estudar malária nas comunidades ribeirinhas em Rondônia. A foto abaixo mostra a nossa equipe em uma casinha à beira do Rio Preto, tratando toda uma família infectada com P. vivax. O maior problema que encontrei foi a logística mesmo. É tudo muito isolado e montar um laboratório no meio dessas comunidades não é nada fácil. E quando a gente percebe in situ como as pessoas se comportam e como as coisas funcionam nessas regiões, a gente enfim se toca que a implementação de medidas preventivas é quase somente utópica.

Medidas de intervenção profiláticas e terapêuticas inovadoras são então fundamentais para dar uma virada nessa situação. E como todos nós sabemos, a junção de observações vindas de modelos experimentais com abordagens clínico-epidemiológicas pode certamente ser uma ferramenta potente de geração de conhecimentos chave para guiar tais medidas de intervenção. Foi então que conheci os trabalhos de um jovem pesquisador brasileiro lá de Minas. E decidi falar sobre ele, ao invés dos PI's, para servir de incentivo e mostrar quanto promissora é essa moçada aí no Brasil. Bernardo Franklin publicou o primeiro paper em um modelo de malária murina em 2007, e o foco do trabalho foi mostrar que a ativação de células dendríticas e linfócitos T CD4+ via MyD88 pode mediar sintomas da doença, mas não é requerida para o controle imunológico dos parasitas (ver o abstract aqui). Dois anos depois, o Franklin veio mostrar, em um paper no PNAS com dados em camundongos e humanos, que o TLR9 e MyD88 são essenciais para indução inicial de IL-12 e IFN-gama e que a ativação desses mediadores favorece a hiperresponsividade aos agonistas de TLR, o que resulta em uma produção aumentada e não balanceada de mediadores pró-inflamatórios e nos sintomas sistêmicos graves da malária (esse paper você pode ver aqui). Foi então que o cara passou a seguir nessa linha “translational” e foi tentar aprofundar mais aspectos da malária humana. E então publicou outro paper bem interessante mostrando que micropartículas plasmáticas são abundantes durante a malária causada pelo P. vivax, sugerindo que, assim como na malária falciparum, essas micropartículas, na verdade vesículas liberadas por células ativadas ou em apoptose, apresentam potencial de serem biomarcadores de infecção e talvez de gravidade na malária (já este paper encontra-se ali). Mais recentemente, o Bernardo foi adiante e mostrou que níveis circulantes de ácidos nucléicos estão aumentados de acordo com a morbidade da malária causada pelo P. vivax (veja acolá), uma outra investigação claramente focada na identificação de biomarcadores da malária grave. Dentre os diversos papers desse jovem pesquisador, o que mais causou furor foi um bem recente publicado também no PNAS (veja o resumo no Pubmed). Esse paper do Franklin recebeu comentário na Nature (aqui) e também já foi comentado no nosso Blog (veja a postagem). Nesse paper em modelo experimental de malária por P. berghei ANKA, os caras mostram que a neutralização de TLR que reconhecem ácidos nucléicos tem o potencial de servir como ferramenta terapêutica na malária. Eu não conhecia o Bernardo e conversei com ele via email depois de ver a sua produção. Acho que esse espaço do SBlogI deve ser também para divulgar e disseminar gente boa com idéias legais. Resumindo, Bernardo é mais um jovem brasileiro com grande potencial e que deve ser bastante incentivado a dar contribuições cada vez mais relevantes à malária ou o que quer que seja. Vocês poderão ver o CV do Franklin no lattes. E quem sabe surgem colaborações? Boa sorte Bernardo!

Malária, CK2 e o ciclo circadiano

Uberlândia - a discussão sobre malária tem rendido vários posts aqui no blog ultimamente. Dentre todos, o post sobre a alteração do ciclo circadiano do hospedeiro pelo Plasmodium foi o que me deixou mais intrigado... será que o poder de modulação ou evasão dos parasitos não está restrito ao sistema imune? Como o parasito se beneficiaria disso?

Eis que leio um trabalho demonstrando o papel da proteina quinase CK2 na regulação do ciclo circadiano de mamíferos. CK2, juntamente com CKIe, induz a degradação de PERIOD2 (PER2), controlando o relógio biológico de camundongos. O bloqueio de CK2 induz um descontrole na expressão de genes relacionados ao ciclo circadiano dos animais.

A caseína quinase 2 (CK2) atua em diversos processos celulares como a diferenciação, proliferação e translação, tem papel importante no desenvolvimento do câncer, uma vez que sua fosforilação está associada a forte inibição da apoptose. Sua atuação está intimamente relacionada a cascata CREB/CRE, responsável por ativar genes responsivos ao AMP cíclico (cAMP). Estes fatores transcricionais tem como substrato justamente NF-kB, importantíssimo para o desencadeamento de respostas inflamatórias contra protozoários intracelulares, como o Plasmodium. Apesar desta via de sinalização induzir citocinas pró-inflamatórias como TNF-a, sua atuação é majoritariamente regulatória, inibindo a ativação de genes NF-kB dependentes simultaneamente a geração e manutenção das células T regulatórias (Treg).

Voltando para a malária, sabe-se que o Plasmodium possui seu próprio CK2, o qual é essencial para a sobrevivência de estágios sanguíneos do P. falciparum. Outras estudos já demonstraram a importância da via do cAMP nos diferentes estágios de vida do protozoário.

Baseado nos dados acima expostos, a pergunta que deixo para os blogueiros é a seguinte: a alteração no ciclo circadiano dos hospedeiros é benéfica para o desenvolvimento da malária ou representa apenas um ‘efeito colateral’ dos mecanismos de evasão do parasito?

Trabalhos consultados:

Holland Z, Prudent R, Reiser JB, Cochet C, Doerig C. Functional analysis of protein kinase CK2 of the human malaria parasite Plasmodium falciparum. Eukaryot Cell. 2009 Mar;8(3):388-97.

Lee B, Li A, Hansen KF, Cao R, Yoon JH, Obrietan K. CREB influences timing and entrainment of the SCN circadian clock. J Biol Rhythms. 2010 Dec;25(6):410-20.

Trembley JH, Chen Z, Unger G, Slaton J, Kren BT, Van Waes C, Ahmed K. Emergence of protein kinase CK2 as a key target in cancer therapy. Biofactors. 2010 May-Jun;36(3):187-95.

Tsuchiya Y, Akashi M, Matsuda M, Goto K, Miyata Y, Node K, Nishida E. Involvement of the protein kinase CK2 in the regulation of mammalian circadian rhythms. Sci Signal. 2009 Jun 2;2(73):ra26.

Wen AY, Sakamoto KM, Miller LS. The role of the transcription factor CREB in immune function. J Immunol. 2010 Dec 1;185(11):6413-9.

Wurtz N, Chapus C, Desplans J, Parzy D. cAMP-dependent protein kinase from Plasmodium falciparum: an update. Parasitology. 2011 Jan;138(1):1-25.

Nova esperança para o tratamento da malária

Neste mês, Bernardo S. Franklin e colaboradores publicaram um artigo no Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America (PNAS) que descreve o efeito protetor da droga sintética E6446 na malaria e seu mecanismo de ação. E6446 é um antagonista sintético de receptores do tipo Toll que reconhecem ácidos nucléicos (TLR8 e TLR9). Nestes estudos, eles mostraram que a terapia em modelo experimental com a droga, diminuiu a ativação de TLR9 e preveniu a resposta inflamatória exacerbada durante a fase aguda da doença. Além disto, os animais tratados não apresentaram sinais graves causados pela malaria cerebral experimetal. Assim, o estudo sugere o envolvimento destes TLRs na patogênese da malária e chama a atenção para a possibilidade de aplicações terapêuticas com esta droga, na prevenção de respostas inflamatórias deletérias durante a doença.

O artigo recebeu destaque na seção de "Research Highlights" da Nature
(http://www.nature.com/nature/journal/v470/n7335/full/470439a.html).

Parabéns aos nossos colegas imunologistas!

Franklin BS, Ishizaka ST, Lamphier M, Gusovsky F, Hansen H, Rose J, Zheng W, Ataíde MA, de Oliveira RB, Golenbock DT, Gazzinelli RT. Therapeutical targeting of nucleic acid-sensing Toll-like receptors prevents experimental cerebral malaria. Proc Natl Acad Sci U S A. 2011 Feb 8.

Microarranjo de proteinas para avaliação de anticorpos na malária.

Postado por Bruno Andrade

Um trabalho recente no PNAS (A prospective analysis of the Ab response to Plasmodium falciparum before and after a malaria season by protein microarray; PNAS 107:6958-6963, 2010 ; doi: 10.1073/pnas.1001323107) avalia, através de metodologia de alto desempenho, os possíveis alvos de anticorpos protetores na malaria por P. falciparum.

Há bastante tempo se sabe que o desenvolvimento de anticorpos anti-parasita na malária ocorre somente alguns anos após a exposição ao parasita. Também não é recente o reconhecimento da importância dos anticorpos na imunidade da malaria, contudo pouco se sabe dos alvos dos anticorpos, em especial aqueles com papel protetor. O trabalho contribui de forma importante para a compreensão do problema ao realizar um microarranjo com cerca de 23% do proteoma do P. falciparum testado em soro de 220 indivíduos.

É promissor que 49 proteínas do P. falciparum, medidas antes e depois do período da malária, aumentem em em crianças infectadas que não desenvolveram doença em relação a crianças que ficaram doentes. Seriam estas proteínas candidatas para uso em imunoproteção? Muito cedo ainda para concluir isto. Os autores reconhecem que são necessários mais estudos, inclusive em outras áreas endêmicas, para uma melhor compreensão da imunidade humoral protetora na malária falciparum.

Veja o resumo do artigo:

“Abs are central to malaria immunity, which is only acquired after years of exposure to Plasmodium falciparum (Pf). Despite the enormous worldwide burden of malaria, the targets of protective Abs and the basis of their inefficient acquisition are unknown. Addressing these knowledge gaps could accelerate malaria vaccine development. To this end, we developed a protein microarray containing ∼23% of the Pf 5,400-protein proteome and used this array to probe plasma from 220 individuals between the ages of 2–10 years and 18– 25 years in Mali before and after the 6-month malaria season. Episodes of malaria were detected by passive surveillance over the 8- month study period. Ab reactivity to Pf proteins rose dramatically in children during the malaria season; however, most of this response appeared to be short-lived based on cross-sectional analysis before the malaria season, which revealed only modest incremental increases in Ab reactivity with age. Ab reactivities to 49 Pf proteins measured before the malaria season were significantly higher in 8– 10-year-old children who were infected with Pf during the malaria season but did not experience malaria (n = 12) vs. those who experienced malaria (n = 29). This analysis also provided insight into patterns of Ab reactivity against Pf proteins based on the life cycle stage at which proteins are expressed, subcellular location, and other proteomic features. This approach, if validated in larger studies and in other epidemiological settings, could prove to be a useful strategy for better understanding fundamental properties of the human immune response to Pf and for identifying previously unde- scribed vaccine targets.”

Você acha que esta metodologia é promissora?

Você investiria tempo/dinheiro na validação desta abordagem para a malária ou outras patologias?

Imagem: Richard J. Pleass and Anthony A. Holder. Antibody-based therapies for malaria. Nature Reviews Microbiology 2005 3, 893-899 doi:10.1038/nrmicro126