Associação entre a Expressão de CD47 em Eritrócitos Jovens e Maduros, Capacidade fagocítica e Carga Parasitária na Infecção Murina pelo Plasmodium yoelii

Biotinilação in vivo separa a população de eritrócitos jovens dos maduros com níveis diferenciais de expressão de CD47. (A) As três dosagens de biotina nos dias consecutivos ao desafio recobrem todos os eritrócitos em camundongos selvagens C57BL/6, antes de desafiá-los com o Plasmodium yoelii, contendo a proteína GFP (GFP-PyNL). Inicialmente, os eritrócitos são 100% positivos, após marcação in vitro com estreptatividina-APC. Gradualmente, o acúmulo de eritrócitos jovens (diagrama de fluxo representativo no retângulo inferior) é observado com a perda da população de eritrócitos maduros (diagrama de fluxo representativo no retângulo superior); d= dias após infecção. (B) A média ± erro padrão do percentual de eritrócitos jovens e maduros durante o curso da infecção estão plotados no gráfico da direita. Fonte: Banerjee et al., março 2015. PNAS.

Espécies de Plasmodium exibem uma forte preferência por infectar eritrócitos jovens, o que pode vir a ser um dos determinantes principais da gravidade da malária e sua patogênese. A base molecular que fundamenta essa preferência e a sua influência na carga parasitária ainda não está completamente elucidada.

Em trabalho recente publicado no PNAS, o qrupo de pesquisa liderado pelo Dr. Sanjai Kumar do Laboratory of Emerging Pathogens, Center for Evaluation and Biologics Research, FDA nos Estados Unidos, abordou a associação entre infecção por Plasmodium x carga parasitária x idade dos eritrócitos, considerando-se como proteína-alvo o CD47. Essa proteína está presente na maioria das células, incluindo eritrócitos, e em conjunto com a proteína alfa reguladora de sinal expressa em macrófagos, previne o clareamento das células pelo sistema imune.

No estudo foi investigado o papel de CD47 no crescimento e sobrevivência de Plasmodium yoelli 17XNL em camundongos C57BL/6 (PyNL). Utilizando parasitos expressando GFP, os pesquisadores demonstraram que eles preferencialmente infectam eritrócitos jovens altamente positivos para CD47. Além disso, camundongos deficientes em CD47 foram resistentes à infecção por PyNL e apresentaram picos de parasitemia 9,3 vezes menor do que os camundongos selvagens. Durante a fase aguda da infecção, essa resistência aumentada à malária observada nos camundongos deficientes de CD47 estava associada à elevação da frequência de células esplênicas F4/80+ que, por sua vez, apresentavam frequência maior de fagocitose de eritrócitos parasitados em comparação às células de camundongos selvagens. Adicionalmente, a injeção de anticorpos neutralizantes para CD47 induziu uma redução significativa na carga parasitária em camundongos selvagens.

Esses resultados sugerem que eritrócitos jovens que expressam alta densidade de CD47 servem como um escudo para o Plasmodium, protegendo-o da eliminação pelas células fagocíticas. Esse pode ser um dos mecanismos de escape utilizados pelo Plasmodium que preferencialmente infecta eritrócitos jovens. Modulação dos níveis de CD47 com o uso de anticorpos anti-CD47 poderá futuramente ser uma alternativa terapêutica empregada em pacientes com malária grave.

Referência:

Banerjee R, Khandelwal S, Kozakai Y, Sahu B, Kumar S. CD47 regulates the phagocytic clearance and replication of the Plasmodium yoelii malaria parasite. Proc Natl Acad Sci U S A. 2015 Mar 10;112(10):3062-7. doi: 10.1073/pnas.1418144112.

Inflamassomo é alvo terapêutico para a doença de Alzheimer

A doença de Alzheimer é uma desordem neurodegenerativa caracterizada por um processo progressivo de morte celular neuronal e pelo desenvolvimento de demência. Um evento importante na progressão desta doença é o acúmulo da proteína b-amilóide (Ab). A proteína Ab é clivada a partir da proteína precursora amilóide (APP) e fica depositada em placas no ambiente extracelular. A microglia é ativada pela proteína Ab e produz moléculas com efeitos neurotóxicos como TNF e iNOS. Recentemente dois trabalhos demonstraram a importância de receptores da imunidade inata na ativação da microglia pela proteína Ab. Em 2008, o grupo do Dr. Douglas Golenbock mostrou que a proteína Ab é capaz de ativar o inflamassomo NLRP3 em células de microglia e que esta via é essencial para a produção de moléculas próinflamatórias, quimiotáticas e neurotóxicas (Halle, 2008). No ano seguinte foi a vez do grupo da Dr. Kathryn Moore demonstrar o envolvimento do complexo de sinalização CD36-TLR4-TLR6 na indução dos efeitos deletérios da proteína Ab (Stewart, 2009). É interessante observar que a sinalização mediada pelo complexo CD36-TLR4-TLR6 prima as células para a ativação do inflamassomo uma vez que é essencial para a expressão de pró-IL-1b.

Na última semana, em uma palestra na Fiocruz-RJ, o Dr. Golenbock apresentou resultados in vivo que sugerem o envolvimento do inflamassomo NLRP3 no desenvolvimento da doença de Alzheimer. Para isso, camundongos transgênicos APP/PS1+NLRP3-/- foram gerados. Os camundongos transgênicos APP/PS1 transportam uma APP quimérica camundongo/humano e a presenilina-1 humana mutada e apresentam grande quantidade de proteína Ab depositada em várias regiões do cérebro a partir de 4 meses de vida. Os resultados demonstraram que animais APP/PS1+NLRP3-/- tiveram um melhor desempenho em um teste de cognição (Morris water maze) quando comparados com animais APP/PS1. Além disso, células no cérebro de animais APP/PS1+NLRP3-/- fagocitam mais do que as células dos animais APP/PS1. Embora não saiba porque, o Dr. Golenbock acredita que este evento, aliado a uma maior metabolização das proteínas Ab, seja importante para o fenótipo observado nos animais APP/PS1+NLRP3-/-, uma vez que o acúmulo dessas proteínas no ambiente extracelular possui efeitos deletérios. Além disso, amostras de cérebros de pacientes com Alzheimer mostraram uma alta ativação de caspase-1 comparado com amostras de pessoas sem a doença. O Dr. Golenbock sugere que a utilização de drogas como o Anakinra, um antagonista da IL-1b, que agem em proteínas da via do inflamassomo poderiam ser utilizadas em protocolos alternativos para tratar a doença de Alzheimer. No entanto, embora a IL-1b seja um importante mediador do processo inflamatório nesta doença, Shaftel e colaboradores mostraram que a inflamação promovida pela superexpressão de IL-1b em animais APP/PS1 melhora a patologia em torno das placas amilóides (Shaftel, 2007). Os autores sugerem que esse fenótipo se deve a maior fagocitose das proteínas amilóides por células da microglia ativadas com IL-1b.

Mas será que tudo tem a ver com IL-1b? Os dois trabalhos fazem menção a fagocitose como processo essencial dos fenótipos encontrados. Lembro aos leitores que a IL-1b e a IL-18 não parecem ser os únicos substratos da caspase-1. Foi mostrado, por exemplo, que proteínas da via glicolítica podem ser clivadas pela caspase-1 (Shao, 2007). Além disso, a caspase-1 está envolvida com a exportação de diversas proteínas pela via não-convencional de secreção, ou seja, independente da via RE/Golgi (Keller, 2007). Com cereteza, ainda vamos nos deparar com funções da caspase-1 associadas com vias metabólicas, sobrevivência celular e reparo tecidual.

Então ficam as perguntas: Será que o tratamento com Anakinra, um antagonista da IL-1b, é capaz de reduzir a progressão desta doença? Como explicar o efeito benéfico do processo inflamatório promovido pela IL-1b em animais APP/PS1? Será que a regulação de vias metabólicas pelo inflamassomo contribuem para o fenótipo descrito nos animais APP/PS1+NLRP3-/-? Qual a relação entre a ativação do NLRP3 e a fagocitose?

Esse post foi escrito por Fabianno F. Dutra, pós-doc no Laboratório de Inflamação e Imunidade/Instituto de Microbiologia/UFRJ

Referências

Halle, A. et al. The NALP3 inflammasome is involved in the innate immune response to amyloid-β. Nat. Immunol., 2008.

Stewart, C.R. et al. CD36 ligands promote sterile inflammation through assembly of a Toll-like receptor 4 and 6 heterodimer. Nat. Immunol., 2009.

Shaftel, S.S. et al. Sustained hippocampal IL-1β overexpression mediates chronic neuroinflammation and ameliorates Alzheimer plaque pathology. J. Clin. Invest., 2007.

Shao, W. et al. The Caspase-1 Digestome Identifies the Glycolysis Pathway as a Target during Infection and Septic Shock. J. Biol. Chem., 2007.

Keller, M. et al. Active Caspase-1 Is a Regulator of Unconventional Protein Secretion. Cell, 2007.

De Metchnikoff ao silenciamento gênico em macrófagos

Figura: quackcartoon.com/ Quackpages/macrophages.htm

Desde a descoberta da fagocitose, por Elie Metchnikoff, que foi contemplado com o Nobel de Fisiologia e Medicina em 1908, os cientistas desenvolveram uma verdadeira fascinação pelo estudo dos macrófagos. Não é para menos, afinal essas células maravilhosas desempenham funções importantíssimas, como: apresentação de antígenos; secreção de citocinas e mediadores inflamatórios; fagocitose e eliminação de micróbios e patógenos; fagocitose de células apoptóticas, entre outras. Diante disso, existe grande interesse no estudo de mecanismos genéticos que expliquem esses fenômenos. Infelizmente, a intervenção em genes em macrófagos primários (transfecção, deleção, silenciamento) é extremamente ineficaz e geralmente ficamos limitados ao uso de animais geneticamente modificados.

Recentemente, um trabalho publicado no Journal of Immunological Methods (doi:10.1016/j.jim.2009.12.002) reporta o silenciamento efetivo de genes de macrófagos primários utilizando RNA de interferência. Os autores demonstram que genes específicos podem ser eficientemente silenciados por eletroporação de siRNA. Aparentemente, o processo não afeta a viabilidade, não impede a ativação induzida por LPS e nem a capacidade de fagocitose e eliminação de micróbios intracelulares. O método é promissor: será que poderemos ficar livre, ou reduzir o uso de animais nocautes? Será que é possível interferir com dois genes simultaneamente, e assim inferir sobre os mecanismos de sinalização intracelular? Vale a pena pagar para ver.