Anastase e a vida pós-apoptose

Por Gabriel Shimizu Bassi (FMRP-IBA) 

Por décadas havia o consentimento geral de quando uma célula entra em apoptose, a morte celular é algo fatídico e irreversível. A apoptose em si é benéfica para o desenvolvimento natural do organismo, porém também é maléfica em eventos traumáticos, tais como derrames encefálicos, ataques cardíacos e doenças degenerativas, tais como o Parkinson e o Alzheimer. Durante o processo apoptótico, alterações físicas são encontradas na célula (blebs) e várias proteínas são expressas e outras são suprimidas. Porém, ficava a dúvida se o processo de apoptose poderia ser reversível.

Em um experimento um tanto inusitado, Tang e colaboradores (2012) expuseram vários tipos celulares (hepatócitos, cardiomiócitos, macrófagos, células HeLA, NIH 3T3 e neuroniais) em meio contendo etanol, DMSO ou cucurbitacina I. Como esperado, as células começaram a apresentar os sinais clássicos de entrada na apoptose, tais como diminuição do corpo celular e nuclear, blebbing e deformidades de organelas. Porém, quando se removeu o composto apoptótico, essas mesmas células começaram a voltar a sua conformidade normal, reorganizando organelas, núcleo e membrana plasmática. Porém, quais os mecanismos envolvidos nessa “ressurreição” celular?

Um estudo mais aprofundado mostrou que durante a apoptose houve ativação da Caspase 3, assim como a translocação nuclear de AIF mitocondrial e EndoG e fragmentação nuclear em micron, sugerindo dano ao DNA e quebra cromossômica. A remoção dos indutores apoptóticos reduziu a expressão dessas proteínas, mostrando que o processo de morte pode ser revertido mesmo após dano ao DNA. Mas como a célula reverte a apoptose e mantém o DNA íntegro?

Imediatamente após a remoção do estímulo apoptótico, uma nova síntese de RNA se iniciou sob influência de genes clássicos de sobrevivência celular, tais como da família BCL-2 (Bag3, Bcl2, Mcl1), XIAP, MDM2, proteínas de choque térmico (Dnajb1, Dnajb9, Hsp90aa1, Hspa1b e Hspb1). 

Modelo proposto para a apoptose reversa (anastase)

Esses dados mostram que a apoptose é um mecanismo reversível, ocorrendo tanto em células normais como em cancerosas. A esse fenômeno os autores cunharam o termo “anastase”, designando, em grego, “retorno a vida”, contrastando com a palavra apoptose (“queda”).

Em termos práticos, a anastase em si pode explicar o aumento a propensão de câncer na ocorrência de danos celulares repetidos. Além disso, a anastase pode ser um dos mecanismos utilizados por células cancerosas para desenvolverem resistência a quimio e radioterapia, tendo-se como resultado o rearranjo gênico e, em alguns casos, o aumento da agressividade e propensão metastática. Levando-se para um lado mais evolutivo, a anastase é um mecanismo de sobrevivência pelo qual a célula pode se utilizar quando há estresses ambientais, resultando em rearranjo gênico e aumentando sua probabilidade de sobrevivência (adaptabilidade) num ambiente hostil.

Fonte: Tang et al. Cell survival, DNA damage, and oncogenic transformation after a transient and reversible apoptotic response. Mol BiolCell, 23: 2240-2252, 2012.

Granuloma: vilão da tuberculose

Um dos conceitos mais tradicionais da imunologia – de que o granuloma tem um papel protetor contra a tuberculose – foi destruído por uma série de pesquisas elegantes da Dra. Lalita Ramakrishnan, de Seattle, USA. A visão tradicional era de que o granuloma serve para “emparedar” as bactérias, constituindo uma barreira contra a infecção. O novo conceito que emergiu é de que, ao contrário, o granuloma é formado por instrução do próprio Mycobacterium tuberculosis; no seu interior, a morte e fagocitose de macrófagos infectados são utilizadas como uma fábrica de novas bactérias, e fonte de disseminação da infecção.

   

Dra. Lalita Ramakrishnan, University of Washington, Seattle, USA

Os estudos recentes utilizaram os tecidos transparentes de larvas do peixe-zebra - que permitem a visualização microscópica da formação do granuloma ao vivo – e também granulomas hepáticos no camundongo. Com surpresa, foi verificado que a entrada de macrófagos no granuloma é inteiramente controlada pelas bactérias, e não pelo sistema imune. Bactérias virulentas expressam produtos do locus RD1, um sistema de secreção do tipo VII, incluindo a proteína ESAT6. ESAT6 é liberada de micobactérias extracelulares, e também de macrófagos infectados através da formação de poros. ESAT6 induz a produção de MMP9 (metaloproteinase de matriz-9) pelo epitélio. MMP9 é o principal agente recrutador de novos macrófagos pelo granuloma (ver Figura). Macrófagos recrutados entram nos granulomas e permanecem altamente móveis e emitindo membranas, até encontrar e fagocitar vesículas de macrófagos infectados que morreram por apoptose. Estes restos contêm bactérias viáveis, e as bactérias vão crescer nestes novos macrófagos, amplificando a infecção. A fagocitose de corpos apoptóticos inativa as funções microbicidas do macrófago, tornando-o uma “incubadora” de bactérias. Embora a infecção cause necrose e apoptose de macrófagos através de ESAT6, a necrose tem um efeito ainda mais deletério para o hospedeiro. Isto é porque a necrose vai liberar bactérias no meio extracelular e, ao contrário do que se pensava, micobactérias crescem de forma exuberante no meio extracelular, sendo fagocitadas e amplificando mais a infecção.

Figura. Mecanismo de recrutamento de macrófagos para granulomas através da indução de MMP9 em células epiteliais. A proteina de M. tuberculosis ESAT6 pode ser liberada de bactérias extracelulares (consequência de necrose de macrófagos infectados) ou de macrófagos infectados íntegros, através do sistema ESX-1 de formação de poros, que é codificado pelo locus de virulência RD1. ESAT6 induz secreção de MMP9 por células epiteliais, que por sua vez induz motilidade exacerbada e recrutamento de novos macrófagos por um mecanismo não totalmente esclarecido (retirado da referencia 1).

Outro dogma derrubado foi de que o TNF seria responsável pela formação do granuloma, e que na ausência de TNF, os granulomas não se formam e a infecção é mais grave. Os novos estudos mostraram que, na ausência de TNF, os granulomas são formados de forma mais acelerada (referência 4). No entanto, as bactérias proliferam mais, e levam os macrófagos à necrose. O excesso de necrose é que destrói a estrutura dos granulomas, dando a impressão de que eles não haviam sido formados.     

Os estudos com o peixe-zebra confirmaram que a disseminação da infecção se dá pela emigração de macrófagos infectados do granuloma primário e estabelecimento de granulomas à distância. Portanto, através dos produtos do locus RD1, as micobactérias exploram processos que normalmente são protetores para o hospedeiro - como apoptose, quimiotaxia de macrófagos e fagocitose de células apoptóticas – para aumentar o seu número e consolidar a infecção.

Referências:

1. Ramakrishnan L. Revisiting the role of the granuloma in tuberculosis. Nat Rev Immunol. 12: 352-366, 2012.

2. Volkman HE, Pozos TC, Zheng J, Davis JM, Rawls JF, Ramakrishnan L. Tuberculous granuloma induction via interaction of a bacterial secreted protein with host epithelium. Science. 327: 466-469, 2010.

3. Davis JM, Ramakrishnan L. The role of the granuloma in expansion and dissemination of early tuberculous infection. Cell. 136: 37-49, 2009.

4. Clay H, Volkman HE, Ramakrishnan L. Tumor necrosis factor signaling mediates resistance to mycobacteria by inhibiting bacterial growth and macrophage death. Immunity. 29: 283-294, 2008.

Post de George A. DosReis

Como o sistema imune trata os mortos?

Diferentes vias podem induzir a morte celular durante o desenvolvimento e ao longo da vida de um organismo. No sistema imune é particularmente importante o papel da morte celular, devido à necessidade de manter um pool de células efetoras e eliminar uma população que proliferou em resposta a um patógeno determinado, uma vez que o micro-organismo tenha sido eliminado. O fundamento central da resposta imune é desafiado enormemente nesse contexto. Como manter a capacidade de combater eficientemente o estranho, sem induzir uma resposta auto-agressiva, nessa maré de antígenos próprios e estranhos durante uma resposta inflamatória? Lembrando que, uma certa resposta frente a antígenos próprios pode ser necessária, por exemplo, para controlar tumores. Como disse a Cris Bonorino no post sobre este assunto: Death rocks. 

Um indício do complexo que pode resultar o assunto é a variedade de hipóteses que têm sido propostas para explicar como as diferentes formas de morte celular influenciam a resposta imune.  Vale a pena ler uma serie de revisões publicadas recentemente sobre mecanismos de morte celular, e como a mesma induz vários efeitos sobre outras células, tendentes a diminuir o impacto da morte celular no organismo (Immunity, 35(4)).

Além do tipo de morte celular que aconteceu (seja devido a um dos 3 tipos de apoptose, à autofagia, ou a necrose), é importante reconhecer, algumas circunstancias:

• O tipo de célula que morreu (Não é a mesma coisa a morte de um fibroblasto de um tecido, como consequência do turnover celular do que a morte de uma célula dendrítica, por exemplo).
• O quê a célula morta está liberando no micro ambiente (relacionado com o item anterior, e com o estado prévio de ativação, transformação ou infecção da célula, além dos sinais find me and eat me).
• Quando a célula morreu (por exemplo, células T ativadas possuem CD154 o que as torna potentes imuno-estimuladoras quando entram em apoptose, o que não acontece com células T naïves. Também é importante mencionar o tempo em que o sistema imune captura as células apoptóticas. A rápida remoção de células apoptóticas evita respostas imunes desnecessárias).
• Onde a célula morreu (por exemplo, é sabido que o baço pode favorecer respostas tolerogênicas, principalmente devido à presença de células CD8a+).
• O porquê a célula morreu (Por exemplo, células que entram em apoptose devido a uma infecção intracelular expressam ligantes de TLR e diversas moléculas induzidas pela infecção, e estão envolvidas na indução de Th17).

Parece simples, mas a aplicação dessas típicas perguntas (as cinco W por who, what, when, where and why) ajuda a compreender as circunstâncias que favorecem ou evitam a indução da resposta imune frente a células mortas em diferentes contextos. Ou poderíamos dizer que o sistema imune está regulado de acordo a como se tratam os mortos?

O trato que o sistema imune dá às células mortas depende das circunstâncias 

da morte celular. E tem consequências distintas, pudendo levar à indução de

 tolerância ou ativação da resposta imune. (Tomado de Griffith TS, Ferguson TA

Immunity. 2011 Oct 28; 35(4):456-66 )

Referências:
1. Griffith TS, Ferguson TA. Immunity. 2011 Oct 28; 35(4):456-66
2. Ravichandran KS. Immunity. 2011 Oct 28; 35(4):445-55
3, Levine B, Mizushima N, Virgin HW. Nature. 2011 Jan 20;469(7330):323-35.

Neutrófilos apoptóticos e fenótipo regulador de macrófagos

Post de Valéria Borges

A interação de neutrófilos e macrófagos define eventos chave da resposta imune inata durante a infecção por diferentes patógenos. Os mecanismos deflagrados pelo reconhecimento e fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos infectados por parasitas do gênero Leishmania tem sido tema de vários artigos do grupo liderado por Dr George Alexandre dos Reis (IBCCF,UFRJ) ⁽¹⁾. A interação de neutrófilos apoptóticos com os macrófagos leva a uma resposta dependente do “background” genético do hospedeiro que irá determinar a morte ou sobrevivência da Leishmania.

Por outro lado, sabe-se que a resposta funcional de macrófagos aos estímulos do ambiente leva a uma diferenciação em sub-populações com fenótipo denominado M1 ativados classicamente ou M2a ativados alternativamente. Uma terceira população denominada de macrófagos regulatórios ou M2b expressam um fenótipo  IL-12^lowIL-10^high que esta associado a supressão da resposta inflamatória e induz uma diferenciação do tipo Th2. 

Recente publicação do grupo, no Journal of Immunology (“Proinflammatory Clearance of Apoptotic Neutrophils Induces an IL-12^lowIL-10^high Regulatory Phenotype in Macrophages”) ⁽²⁾, teve como objetivo investigar o fenótipo de macrófagos induzido pela fagocitose de neutrófilos apoptóticos e se essa mudança de perfil é estável após a subseqüente reestimulação com LPS, bem como suas implicações na infecção por Leishmania major.

Dentre os principais achados, os autores mostram que macrófagos derivados de medula óssea, previamente estimulados pela fagocitose de neutrófilos pró-inflamatórios de camundongos C57BL/6, mas não neutrófilos de BALB/c, expressam um fenótipo regulatório/M2b caracterizado por uma baixa produção de IL-12 com alta produção de IL-10, altos níveis de secreção de TNF e óxido nítrico. A indução de macrófagos regulatórios do tipo M2b induziu resposta de linfócitos do tipo Th2 e esteve associada a atividade da enzima elastase neutrofílica, sendo parcialmente dependente da sinalização por TLR4. Todo esse ambiente permissivo favorece a replicação intracelular de L. major em células infectadas.

Os resultados obtidos nesse estudo sugerem que a fagocitose de neutrófilos apoptóticos além de ser importante no processo de resolução da inflamação pode direcionar a diferenciação de macrófagos para um fenótipo regulatório, contribuindo para uma resposta humoral aumentada e persistência do parasita na célula hospedeira. 

Referências:

1. Ribeiro-Gomes FL, Silva MT, Dosreis GA. Neutrophils, apoptosis and phagocytic clearance: an innate sequence of cellular responses regulating intramacrophagic parasite infections. Parasitology. 2006;132 Suppl:S61-68.

2. Filardy AA, Pires DR, Nunes MP, Takiya CM, Freire-de-Lima CG, Ribeiro-Gomes FL, Dosreis GA. Proinflammatory Clearance of Apoptotic Neutrophils Induces an IL-12lowIL-10high Regulatory Phenotype in Macrophages. J Immunol. 2010 Aug 15;185(4):2044-2050.

IL-32: proteção ou exacerbação da patogênese na infecção por M. tuberculosis?

Post de Theolis Barbosa Bessa 

Originalmente publicado no Sciencia totum circumit orbem.

 A apoptose de macrófagos infectados porMycobacterium tuberculosis parece ser um importante mecanismo de defesa contra o bacilo. As bactérias liberadas das células pouco responsivas podem dessa forma ser disponibilizadas para fagocitose e destruição intracelular por macrófagos ativados recrutados para o local de infecção. Corroborando essa hipótese, a capacidade de inibição da apoptose dos macrófagos hospedeiros tem sido relacionada à virulência de micobactérias (Velmurugan et al. 2007). A indução de apoptose em macrófagos infectados por M. tuberculosis está associada à sinalização pelos receptores toll-like 2 e 4, e à produção de TNF (Sánchez et al. 2009) e de superóxido (Hinchey et al. 2007). 

A IL-32 é uma citocina pró-inflamatória produzida por linfócitos T, células NK, monócitos e células epiteliais, sendo estas últimas a fonte predominante da citocina. Ela é encontrada em 4 variantes de splicing (IL-32α, IL-32β, IL-32δ e IL-32γ), sendo mais abundante o transcrito IL-32α. Sua produção é estimulada por IFN-γ e essa citocina tem como efeito o aumento da produção de IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF. A IL-32 aparentemente não é secretada; sua liberação ocorreria apenas por morte celular. A liberação de IL-32 tem sido associada à indução de apoptose e à amplificação da inflamação nas doenças inflamatórias crônicas do intestino e na artrite reumatóide, além da infecção tuberculosa (Andoh et al.2008).

No artigo de Bai e colaboradores (2010) os autores demonstram que na infecção de células humanas de linhagem macrofágica THP-1 com M. tuberculosis a IL-32 tem papel na indução de apoptose, que é pelo menos em parte mediada pela caspase 3. A inibição da produção de IL-32 também foi associada à grande diminuição da produção de TNF e ao aumento da carga bacilar nos macrófagos infectados, sugerindo um papel direto da IL-32 e da apoptose no controle do bacilo. Cabe ressaltar, no entanto, que a IL-32 também foi implicada na apoptose de linfócitos T induzida por ativação (Goda et al. 2006), e elevada apoptose destas células em indivíduos com tuberculose ativa foi associada à anergia nestes pacientes (Abebe et al. 2010). Como observado na literatura em relação ao TNF, é possível que a IL-32 tenha papel dual na infecção por M. tuberculosis, estando implicada tanto na proteção quanto na exacerbação da doença.

Bai, X., Kim, S., Azam, T., McGibney, M., Huang, H., Dinarello, C., & Chan, E. (2010). IL-32 Is a Host Protective Cytokine against Mycobacterium tuberculosis in Differentiated THP-1 Human Macrophages The Journal of Immunology, 184 (7), 3830-3840 DOI:10.4049/jimmunol.0901913

Ilustração.