Journal Club IBA: TH17 cells transdifferentiate into regulatory T cells during resolution of inflammation

As células Th17 são caracterizadas pela produção de IL-17A, IL-17F, IL-22 e IL21 e pela expressão do fator de transcrição RORγT.  Essas células estão envolvidas na proteção contra bactérias extracelulares e fungos, além de desempenharem importante papel na patogênese de doenças autoimunes, como esclerose múltipla, psoríase e artrite reumatoide. Interessantemente, o desenvolvimento de células Th17 e células T reguladoras (T reguladoras FOXP3⁺ induzidas ou Tr1 produtoras de IL-10) é interconectado, sendo ambos dependentes de TGF-β. Portanto, o balanço entre esses tipos de células influencia o desenvolvimento de respostas inflamatórias à antígenos estranhos ou próprios, de modo que o desequilíbrio na relação células Th17/T reguladoras pode estar relacionado ao desenvolvimento de doenças autoimunes, inflamação crônica e tolerância a patógenos. Além disso, estudos recentes demonstraram que as células Th17, dependendo do microambiente, podem se diferenciar (in vitro e in vivo) em células produtoras de IL-10, além de coexpressar RORγT e FOXP3⁺, enquanto células T reguladoras também podem se tornar produtoras de IL-17. Contudo, não é conhecido se a plasticidade das células Th17/T reguladoras reflete apenas uma mudança no perfil de citocinas produzidas ou se essas células sofrem um processo de transdiferenciação, ou seja, sofrem reprogramação de um tipo de celular para outro. (1,2,3)

Com o intuito de avaliar a transdiferenciação de células Th17 para um perfil regulador in vivo, foi utilizado o modelo animal chamado Fate⁺, que consiste no cruzamento de um animal IL-17A repórter (IL-17A^CRE x Rosa26 STOP^fl/fl YFP (R26^YFP)) com o animal triplo repórter IL-17A^Katushka IL-10^eGFP Foxp3^RFP. O animal resultante Fate⁺, após a expressão de Il17a, deleta o cassete R26^YFP e está marcado permanentemente pela expressão de YFP. A construção de tal modelo possibilitou aos pesquisadores testar a expressão de IL-17A, IL-10 e Foxp3 em células YFP⁺, de forma ex vivo sem a necessidade de novo estímulo in vitro.

                  Foi realizado um experimento utilizando anticorpo monoclonal anti-CD3 (anti-CD3 mAb) nos animais, com o intuito de mimetizar uma resposta inflamatória, pois anti-CD3 mAb causa uma resposta inflamatória autolimitante nos animais. Foi observada expansão da população de células Th17, seguida pelo aumento de células IL-17A^Katushka- YFP+ (denominadas ExTh17), sendo que porção destas células também expressavam IL-10^eGFP e que foram então denominadas TR1^ExTh17(IL-17A^Katushka- YFP⁺ IL-10^eGFP).

Os autores propuseram então 2 modelos para explicar a formação de células TR1^ExTh17 durante uma resposta imune, sendo que o primeiro modelo defende a ideia de que células Th17 podem sofrer conversão para células TR1 em situações basais e que durante a resposta imune ocorreria a expansão desses grupos de células. O segundo modelo propõe que as células Th17 podem sofrer a conversão para TR1 durante o curso de uma resposta imunológica. Para averiguar qual dos dois modelos estava acontecendo, foi gerado um animal chamado iFate, no qual as células Th17 só se tornam YFP⁺ após tratamento com a droga tamoxifeno. Com o uso dessa estratégia foi possível perceber que o segundo modelo proposto é o mais adequado, pois células Th17 sofrem conversão para TR1 durante o decorrer da resposta imune.

O próximo aspecto avaliado foi se as células TR1^ExTh17 sofriam reprogramação transcricional durante a conversão de Th17 para TR1. Foi realizado sequenciamento do transcriptoma de diversas populações celulares provenientes do animal Fate⁺ (Th17, ExTh17, Foxp3, Foxp3^IL-10+, TR1 e TR1^ExTh17) e foi construída uma matriz de correlação, onde pode-se verificar a semelhança entre a expressão global de 97 genes selecionados como relevantes para o perfil Th17. Dessa forma foi possível constatar que células TR1^ExTh17 possuem maior semelhança com relação ao perfil transcricional de células TR1, do que quando comparada com qualquer outro tipo analisado. O mesmo tipo de análise foi realizado, focando agora no perfil de expressão de 191 genes relacionados ao perfil de citocinas. Novamente células TR1^ExTh17 possuem maior semelhança com relação ao perfil transcricional de células TR1, do que quando comparado com qualquer outro tipo analisado. Pode-se concluir que a conversão de células Th17 para TR1 é determinada e/ou acompanhada por uma reprogramação do perfil transcricional, um processo que já foi descrito como transdiferenciação. (4, 5)  

Para testar se as células TR1^ExTh17 haviam realmente completado sua transdiferenciação funcional de Th17 para TR1, foi utilizado um modelo de colite mediado pela transferência de células Th17 patogênicas (pTh17) geradas in vitro, na presença de anti-CD3 mAb, IL-6, IL-23, TGF-β, anti-IFN-γ e anti-IL-4. Animais Rag^-/^- receberam essas células pTh17, juntamente com células Th17, ExTh17, TR1 e TR1^ExTh17, provenientes de animais Fate⁺. Foi possível constatar que células TR1^ExTh17 realmente completaram sua reprogramação funcional, pois foram capazes de prevenir a colite mediada por células pTh17.

Foi utilizado também um modelo animal de esclerose múltipla experimental (EAE), para verificar se células Th17 derivadas de uma resposta autoimune seriam capazes de realizar a conversão para células regulatórias. Os experimentos demonstraram que mesmo células ExTh17 desenvolvidas durante resposta autoimune são capazes de realizar a conversão para células TR1. Além disso, células específicas para o antígeno envolvido na EAE foram capazes de expressar maiores níveis de IL-10 do que células não específicas para o antígeno.

Na tentativa de elucidar possíveis vias envolvidas na conversão de Th17 para TR1 foram analisados genes relevantes para perfil Th17 que se encontravam induzidos em células ExTh17 e TR1^ExTh17 nas análises de sequenciamento do transcriptoma. Essa análise revelou associação com a via de sinalização de TGF-β. Em experimentos realizados pelo grupo foi possível observar que TGF-β promove plasticidade de células Th17 e conversão para TR1, de forma dose-dependente. De acordo com Martinez et al. (6), dentre as moléculas envolvidas na via de sinalização de TGF-β, Smad3 diminui atividade de RORγt, consequentemente reduzindo o desenvolvimento de células Th17. Quando os autores bloquearam Smad3 utilizando um inibidor durante a diferenciação in vitro de Th17, ocorreu a diminuição da indução de células TR1^ExTh17. Tais resultados indicam que TGF-β, possivelmente através de Smad3, promove a conversão de Th17 para TR1.

Existem evidências na literatura de que células Th17 e TR1 diferenciadas na presença de TGF-β expressam altos níveis de AhR, que promove ativação de Il10 (7). Para avaliar se a ativação de AhR influencia a conversão de Th17 para TR1, foram realizadas culturas celulares contendo o agonista do receptor AhR (FICZ) e antagonista desse mesmo receptor. Foi observado que a presença de FICZ aumentou consideravelmente o desenvolvimento de células TR1^ExTh17, enquanto a presença do antagonista reduziu a conversão de Th17 para TR1.  

De forma geral, esse estudo demonstrou que células Th17 são capazes de sofrer transdiferenciação para o perfil TR1 durante o desenvolvimento da resposta imune na presença de TGF-β, sendo que ativação de AhR promove a conversão.

Figura 1. Células Th17, partindo de um perfil inflamatório inicial, são capazes de sofrer transdiferenciação para o perfil TR1 (anti-inflamatório) durante o decorrer da resposta imune na presença de TGF-β, através de Smad3 e com a ativação do receptor AhR, que promove a conversão Th17-TR1. As células TR1 que sofreram transdiferenciação são capazes de produzir IL-10.

Referências Bibliográficas

1.    Noack, M.; Miossec P. Th17 and regulatory T cell balance in autoimmune and inflammatory diseases. Autoimmun Rev. 13,  668-677 (2014).

2.    Hirota,K. et al. Fatemapping of IL-17-producing T cells ininflammatory responses.Nature Immunol. 12, 255–263 (2011).

3.    Komatsu,N. et al.Heterogeneity of natural Foxp31 T cells: a committed regulatory T-cell lineage andanuncommittedminor population retaining plasticity.Proc.Natl Acad. Sci. USA 106, 1903–1908 (2009).

4.    Graf, T. & Enver, T. Forcing cells to change lineages. Nature 462, 587–594 (2009).

5.    Komatsu,N. et al. Heterogeneity of natural Foxp31 T cells: a committed regulatory T-cell lineage andanuncommittedminor population retaining plasticity. Proc.Natl Acad. Sci. USA 106, 1903–1908 (2009).

6.    Martinez, G. J. et al. Smad3 differentially regulates the induction of regulatory and inflammatory T cell differentiation. J. Biol. Chem. 284, 35283–35286 (2009).

7.    Apetoh, L. et al. The aryl hydrocarbon receptor interacts with c-Maf to promote the differentiation of type 1 regulatory T cells induced by IL-27. Nature Immunol. 11, 854–861 (2010).

Células com fome! O papel do metabolismo lipídico celular e fusão mitocondrial

Autora: Kelly Grace Magalhães

Pra quem gosta de ler sobre metabolismo lipídico e seu papel na inflamação, foi publicado recentemente um artigo bem interessante sobre o assunto. O artigo foi publicado na Developmental Cell (aqui) e também foi comentado numa revisão publicada na Nature Reviews Molecular and Cell Biology (aqui).  Neles são apresentados novos insights sobre o papel do metabolismo lipídico celular no remodelamento da mitocôndria e estresse oxidativo durante processos de privação de nutrientes para a célula (starvation). Neste estudo, Lippincott-Schwartz e colaboradores demonstraram que durante processos de starvation, corpúsculos lipídicos liberam ácidos graxos, através da lipólise, os quais são captados pela mitocôndria para dar suporte a respiração oxidativa. 

Deveopmental Cell - Volume 32, Issue 6, 23 March 2015, Pages 678–692

Os autores propõe a ocorrência de uma forte interação morfológica entre os corpúsculos lipídicos e mitocôndrias fusionadas para que haja o tráfego de ácidos graxos nesta região celular, através de um processo altamente regulado por lipases citoplasmáticas, autofagia e dinâmicas de fusão mitocondrial, a fim de aumentar ao máximo o metabolismo oxidativo celular e evitar a toxicidade dos ácidos graxos em células submetidas ao processo de privação de nutrientes. Este estudo abre desta forma novas perguntas sobre o papel dos mecanismos envolvidos na modulação da resposta imunológica e inflamatória desencadeada por modificações no metabolismo celular envolvendo corpúsculos lipídicos e vias de geração de espécies reativas de oxigênio da mitocôndria. 

Vale a pena a leitura para quem gosta do assunto!

Lectinas, especificidade e imunologia

Autor: Rômulo Farias Carneiro. Doutorando do Programa de Pós-graduação em Biotecnologia de Recursos Naturais/UFC-CE

Lectinas de Cucumaria echinata: CEL-I

Em 1994, Hatakeyama e colaboradores isolaram quatro lectinas do pepino do mar Cucumaria echina (CEL-I, II, III e IV). As quatro lectinas são dependentes de Ca2+ e reconhecem galactosídeos (galactose, N-acetil-galactosamina e lactose). De lá pra cá, Hatakeyma e seus colegas publicaram mais de cinquenta artigos sobre lectinas deste pepino do mar. Estes trabalhos incluem avaliação da especificidade das lectinas, estudos estruturais e atividades biológicas. Neste post discutiremos o curioso caso da lectina nomeada CEL-1 e como o entendimento desta molécula abre novas perspectivas para o desenho racional de proteínas através de engenharia genética, bem como nos mostra um pouco da importância das lectinas no sistema imune de animais considerados inferiores. Entretanto, ressaltamos que CEL-I é somente um coadjuvante dentre as demais lectinas deste animal. A verdadeira protagonista, CEL-III, talvez seja a lectina de origem marinha mais interessante e de maior potencial que se conhece. 

Visto que invertebrados não possuem sistema imune adaptativo, estas lectinas representam uma importante linha de defesa destes animais contra microrganismos patogênicos. Lectinas do tipo C parecem ser componentes importantes do sistema imune inato, atuando como proteínas de reconhecimento de padrões (Pattern recognition proteins - PRPs), ou seja, proteínas responsáveis por reconhecer padrões bioquímicos não próprios (Pathogen-associated molecular pattern - Padrões moleculares associados a patógenos - PAMPs). A capacidade de distinguir o "próprio" do "não próprio" é devido, claro, a especificidade da lectina pelos carboidratos de superfície do potencial invasor.

Lectinas do tipo C, em geral, reconhecem manose ou galactose. Durante muito tempo se acreditou que a especificidade destas proteínas é determinada por uma trinca de aminoácidos localizada no segundo sítio de ligação a Ca2+. Quando esta trinca de aminoácidos é composta por Glu, Pro e Asn (EPN) a lectina tende a ser ligante de manose. Por outro lado, quando a trinca em questão é Gln, Pro e Asp (QPD) a lectina tende a reconhecer preferencialmente galactose.

Voltando as lectinas de Cucumaria echinata, CEL-I apresenta em sua estrutura primária a trinca QPD, logo sua especificidade deveria ser por galactosídeos, e, de fato, é. Em especial, existe aqui uma alta afinidade por GalNac.

Através de ensaios de mutagênese sítio dirigida, a estrutura primária de CEL-I foi modificada: a trinca QPD foi substituída pela trinca EPN. A proteína mutante (EPN-CEL-I) mostrou ligeira afinidade para manose. Entretanto, EPN-CEL-I manteve alta afinidade por galactosídeos, indicando que a escolha entre galactose e manose não é atribuída somente à trinca de aminoácidos QPD ou EPN.

A estrutura tridimensional da lectina nativa complexada com galactose e da lectina mutante complexada com manose revela a diferença de orientação e, consequentemente, a diferença nas interações entre o carboidrato complexado e o aminoácido na posição 105 (Figura 01). Estas diferenças podem explicar em parte o porquê de uma lectina EPN, contendo H na posição 105, reconhecer manose e uma lectina QPD, contendo W na posição 105, reconhecer galactose. Contudo, não explica o fato de o mutante EPNH-CEL-I ainda apresentar alta afinidade por GalNAc.

O mais coerente parece ser que a manutenção da afinidade por GalNAc deva-se a presença de interações compensatórias, que até agora não estão totalmente esclarecidas.

O fato envolvendo CEL-I é que Hatakeyama e colaboradores parecem ter encontrado muito mais perguntas a responder agora depois de 20 anos de seu trabalho pioneiro. O trabalho deste grupo japonês é notável e suas contribuições para entendimento da relação estrutura/função de lectinas de invertebrados são imensas. A especificidade de CEL-I pode agora ser arquitetada por mutagênese de diferentes aminoácidos e o efeito destas mutações deve ser observado.

Ao longo da evolução dos invertebrados as lectinas do tipo C parecem mesmo ter sido de extrema importância para a manutenção da defesa biológica destes animais. A versatilidade destas lectinas ao reconhecer diferentes ligantes foi, e ainda é muito importante na ausência de um sistema imune adaptativo. Esta versatilidade poderá em um futuro breve ser explorada no desenvolvimento de novas proteínas, através de engenharia genética, para o reconhecimento de quaisquer carboidratos.

Figura 01. Comparação do sítio de reconhecimento a carboidrato de CEL-I nativa(A) e EPNH-CEL-I(B) mutante.



Referências:
HATAKEYAMA, T. et al. Purification and characterization of four Ca(2+)-dependent lectins from the marine invertebrate, Cucumaria echinata. Journal of Biochemistry, v. 116, n. 1, p. 209-214, jul. 1994.
MORIUCHI, H. et al., Mannose-recognition mutant of the galactose/N-Acetylgalactosamine-specific C-type lectin CEL-I engineered by site-directed mutagenesis. BBA, v.1850(7), p.1457-1465.
HATAKEYAMA, T. et al. Alteration of the Carbohydrate-Binding Specificity of a C-type Lectin CEL-I Mutant with an EPN Carbohydrate-Binding Motif, Protein Pept Lett, v.20, p.796-801.
SUGAWARA, H. Characteristic recognition of N-acetylgalactosamine by an invertebrate C-type Lectin, CEL-I, revealed by X-ray crystallographic analysis., J Biol Chem, v.279, p.45219-45225, 2004.
ZELENSKY, A.N.; GREADY, J.E. The C-type lectin-like superfamily. FEBS Journal, v.272, p.6179-61217, 2005.

O Tabagismo Silencia Funções de Células Linfoides Inatas e Facilita uma Resposta Exacerbada Tipo 1 Dependente de IL-33 a Infecções Virais

Figura - Tabagismo exacerba Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) via indução de IL-33, células NK e IFN-gama: Tabagismo induz células epiteliais a produzirem níveis aumentados de IL-33 intracelular, que é liberada sob dano celular por infecções bacterianas ou virais. A exposição ao fumo, via mecanismos ainda indefinidos, modula a expressão do receptor de IL-33 (ST2) em ILC2, mas em paralelo aumenta a expressão de receptores em macrófagos (M0) e células NK. Essas alterações provocam um bloqueio da resposta de ILC2 e a síntese de citocinas Tipo 2, normalmente induzidas por IL-33. Por outro lado, IL-33 é capaz de ativar macrófagos a produzirem IL-12, o que sinergiza com IL33 para induzir proliferação de células NK e a produção aumentada da citocina pró-inflamatória IFN-gama, levando à exacerbação da DPOC. Fonte: Liew FY, Immunity, 2015.

A doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) é uma desordem crônica do pulmão com obstrução progressiva e irreversível do fluxo de ar, associada com resposta inflamatória prolongada e aumentada. O tabaco é conhecidamente um elemento central na resposta alterada a infecções em pacientes portadores de DPOC. A doença é exacerbada por infecções virais por rinovírus ou vírus influenza e infecções bacterianas. Não há tratamento efetivo para DPOC.

Um trabalho publicado recentemente na Immunity pelo grupo liderado pela Dra. Alison A. Humbles do Department of Respiratory, Inflammation and Autoimmunity do MedImmune LLC nos EUA, investigou os efeitos do fumo no desencadeamento de resposta exacerbada frente à infecção pelo vírus influenza em camundongos.

A ausência de sinalização via IL-33 conferiu proteção completa durante a exacerbação e preveniu inflamação acentuada e perda de peso. Os autores demonstraram que o fumo foi necessário para aumentar IL-33 produzida por células epiteliais pulmonares e, simultaneamente, alterar a distribuição de receptores de IL-33 (ST2). O fumo diminuiu a expressão do receptor ST2 no grupo 2 de células linfoides inatas (innate lymphoid cells - ILC2), enquanto induziu a elevação da expressão de ST2 em macrófagos e células NK, alterando a resposta de IL-33 no pulmão.

Durante a infecção, a liberação local de IL-33 amplificou significativamente a resposta inflamatória Tipo 1, sendo capaz de ativar macrófagos a produzirem IL-12 num mecanismo sinérgico com IL-33 para induzir proliferação de células NK e a produção aumentada da citocina pró-inflamatória IFN-gama, levando à exacerbação da DPOC.

Portanto, na DPOC, o fumo altera o microambiente pulmonar, facilitando uma resposta pró-inflamatória acentuada à infecção viral, num mecanismo dependente de IL-33 que leva à exacerbação da infecção.

Referência

- Kearley J, Silver JS, Sanden C, Liu Z, Berlin AA, White N, Mori M, Pham TH, Ward CK, Criner GJ, Marchetti N, Mustelin T, Erjefalt JS, Kolbeck R, Humbles AA. Cigarette smoke silences innate lymphoid cell function and facilitates an exacerbated type I interleukin-33-dependent response to infection. Immunity. 2015 Mar 17;42(3):566-79. doi: 10.1016/j.immuni.2015.02.011.

- Liew FY. Cigarette smoke resets the Alarmin IL-33 in COPD. Immunity. 2015 Mar 17;42(3):401-3. doi: 10.1016/j.immuni.2015.02.014.

Journal Club IBA: HIF-1α induz a reprogramação de monócitos de pacientes sépticos para um fenótipo imunossupressor

Figura 1 - Esquema de um monócito de paciente com sepse. Monócito adquire tanto funções pró-inflamatórias, no início da doença, passando por uma reprogramação dependente de HIF-1a e IRAKM, adquirindo um fenótipo imunosupressor

A sepse é uma resposta inflamatória sistêmica em reposta a infecções por bactérias, fungos ou vírus. Durante a resposta imune na sepse há uma ativação exacerbada da resposta imunológica levando a um aumento de liberação de citocinas pro-inflamátorias (cytokine storm), choque e lesão tecidual (aqui). Para atenuar o dano tecidual gerado, estudos anteriores têm demonstrado um aumento na produção de citocinas anti-inflamatórias como IL-10 e TGF-β, assim como uma menor expressão de moléculas coestimuladoras (CD86) e de moléculas de MHC em monócitos de pacientes sépticos (aqui). No entanto, durante essa condição anti-inflamatória compensatória (do inglês, compensatory anti-inflammatory response syndrome – CARS), indivíduos sépticos tornam-se mais suscetíveis a infecções secundárias. Esses resultados mostram que os monócitos participam tanto da fase pro-inflamatória, quanto da fase anti-inflamatória. No entanto, ainda não está claro qual é a atividade funcional e quais os mecanismos que regulam essas células durante o desenvolvimento da sepse. Para responder estas questões, Shalova e colaboradores (aqui) demonstraram de forma bastante elegante na edição de março de 2015 da revista Immunity que monócitos de pacientes com sepse ativa (isolados poucas horas depois de confirmada a infecção por bactérias gram negativa) apresentam um perfil transcripcional característico de ativação e inflamação, quando comparado com os monócitos desses mesmos pacientes 4-12 semanas depois, uma fase que foi chamada de “recovery phase”. Como esperado, monócitos de pacientes que se recuperaram da sepse apresentaram um perfil transcripcional mais parecido com monócitos de indivíduos saudáveis. Como essa intensa resposta inflamatória gerada na sepse induz uma resposta anti-inflamatória compensatória, o passo seguinte foi avaliar como os monócitos de pacientes com sepse se comportam durante um segundo desafio (estímulo com LPS ex vivo). De forma interessante, foi demonstrado que os monócitos de pacientes com sepse se tornam completamente hiporresponsivos a um desafio com LPS, ativando menos a sinalização de NFκB e consequentemente não produzindo citocinas pró-inflamatórias. Os autores demonstraram que esses monócitos, na verdade, adquirem um fenótipo conhecido como “tolerante a endotoxinas”, caracterizado pela menor produção de citocinas pró-inflamatórias, diminuição da apresentação de antígeno, aumento da fagocitose, capacidade de killing e aumento das funções de reparo tecidual. Isso mesmo, esses monócitos não se tornam completamente “paralisados”. Apesar da resposta de citocinas prejudicada, esses monócitos conseguem fagocitar mais bactéria (ensaio in vitro com E.coli expressando GFP), têm maior capacidade microbicida (ensaio com sobrenadante da cultura de monócitos em uma placa de Agar coberta de E.coli e aumento na expressão do peptídeo anti-microbiano Hamp) e aumentam suas funções de reparo tecidual através do aumento da produção de metaloproteases e VEGF (elegantes ensaios de zimografia, wound healing e angiogênese). Porém, os autores não param por aí. Eles demonstram que essa reprogramação dos monócitos, adquirindo um perfil “imuno-supressor” ou de reparo, ocorre devido à ativação de HIF-1α e, consequentemente de IRAKM (um regulador negativo da sinalização dos TLRs). De forma geral, os autores demonstram que monócitos de indivíduos saudáveis respondem normalmente, ativando NFκB e produzindo citocinas pró-inflamatórias quando estimulados. No entanto, em um quadro de sepse, os monócitos desses indivíduos são ativados a ponto de gerarem o cytokine storm, sofrendo posteriormente uma reprogramação (mediada por HIF-1α e IRAKM), tornando-se células incapazes de produzirem citocinas pró-inflamatórias, mantendo apenas funções de fagocitose, killing e reparo tecidual. Apesar da fagocitose e killing aumentados, é evidente que estas características não são suficientes para controlar infecções oportunistas, como demonstrado pela suscetibilidade aumentada desses pacientes a infecções secundárias. Portanto, este estudo é de suma importância na busca de uma “assinatura gênica global” da resposta imune inata, gerando assim novos caminhos para o tratamento da sepse em humanos.

Post de Annie Piñeros e Frederico Ribeiro, alunos de doutorado IBA/FMRP/USP