IL-33/ST2 com uma pitada brasileira

Structure 17, 1398–1410, October 14, 2009 ª2009 Elsevier Ltd All rights reserved

A IL-33 ou IL-1F11 foi assim rebatizada em 2005 após busca em base de dados por moléculas semelhantes a IL-1 e a demonstração que a IL-33 é agonista do receptor previamente órfão da família da IL-1, o ST2 (Schmitz et al., 2005). A IL-33 é idêntica a moléculas previamente descritas; o produto do gene Dvs27 e ao fator de células endoteliais venosas (NF-HEV) (Liew et al., 2010). Trata-se de uma citocina da família da IL-1, que fica armazenada na forma de pró-IL-33 com 270 e 266 aminoácidos, 30 e 29.9 KDa  em humanos e roedores, respectivamente. Estudos iniciais in vitro sugeriram que da mesma forma que a IL-1 e IL-18, a IL-33 seria ativada pela quebra pela caspase-1 (Schmitz et al., 2005). Porém, isso foi questionado considerando a falta de um sítio para quebra pela caspase-1 e dados demonstrando que a caspase-1 na realidade tornava a IL-33 inativa (Liew et al., 2010). In vivo, existe evidência que a pro-IL-33 é clivada para a forma ativa, IL-33 pela calpaína (Hayakawa et al., 2009) ou mesmo que a elastase e catepsina G derivadas de neutrófilos tem papel na sua maturação (Lefrançais E et al., 2012). Dessa forma, sua maturação ainda é controversa. A IL-33 é expressa em diferentes tecidos como estômago, pulmão, medula espinal, cérebro e pele; e tipos celulares como células dendríticas e macrófagos em situações basais em roedores e após estímulo com TNF-a e IL-1b em humanos (Schmitz et al., 2005). Já o aumento de expressão da IL-33 é detectado após o estímulo com diferentes agonistas de receptores tipo toll em células da glia, sugerindo que a IL-33 seja produzida em respostas à vírus e bactérias (Hudson et al., 2008) e no fígado após a administração de CCl₄, cuja expressão foi sugerida estar associada à fibrose hepática (Marvie et al., 2009).

O membro da família da IL-1 mais semelhante estruturalmente a IL-33 é a IL-18 (Schmitz et al., 2005). Já o receptor mais semelhante à IL-1R e IL-18Ra é o ST2. O ST2 é expresso numa forma solúvel (sST2), ligada a membrana (ST2L) ou numa forma expressa principalmente por órgãos gastrointestinais e baço (ST2V). A IL-33 também induz a transdução de sinal via tal receptor pelo recrutamento de diferentes moléculas como MyD88, IRAK, IRAK4 e TRAF6, o que resulta na ativação de MAP quinases (p38, JNK e ERK) e NFkB em mastócitos in vitro (Schmitz et al., 2005). A proteína acessória do receptor da IL-1 (IL-1RAcP) também faz parte do complexo do receptor da IL-33 (ST2/IL-1RAcP) (Chackerian et al., 2007).

As evidências recentes quanto à participação fisiopatológica da IL-33 demonstram a sua participação na maturação de mastócitos (Allakhverdi et al., 2007), sobrevida, adesão e produção de citocinas por mastócitos (Iikura et al., 2007), e regulando a produção de citocinas por esplenócitos em modelo de asma em camundongos (Hayakawa et al., 2007). Além dos efeitos da IL-33 como uma citocina, existem evidências que a IL-33/ST2 são induzidos por estímulo mecânico e apresentam papel protetor em cardiomiócitos durante estresse mecânico (Sanada et al., 2007), e que assim como a IL-1α e HMGB-1, a IL-33 poderia atuar como um fator intracelular com propriedades de regulação transcricional (Carriere et al., 2007).

Boa parte dos resultados quanto à biologia da IL-33 sugerem que seja uma citocina Th2. Porém, existem dados descrevendo que o tratamento com sST2 inibe a severidade da artrite induzida por colágeno tipo II em camundongos (Leung et al., 2004). Neste trabalho Leung ET al. (2004), ainda não se sabia a identidade do agonista do ST2, mas podemos interpretar que IL-33 atuando em seus receptores ST2L medeia a inflamação em modelo de artrite reumatóide e o tratamento com sST2 sequestraria a IL-33 impedindo sua atividade pró-inflamatória. Corroborando com essa hipótese, Carriere et al., 2007, detectou a expressão de RNA mensageiro para IL-33 em amostras de tecido sinovial de pacientes com artrite reumatóide. Dessa forma, existem evidências de que a IL-33 possa também mediar outras respostas adaptativas além de Th2. Nesse sentido, demonstramos que a IL-33 medeia a hiperalgesia (“dor”) articular e cutânea em modelo de inflamação em camundongos imunizados e desafiados com mBSA por induzir a produção de citocinas (TNFα, IL-1β, IFNγ) e outros mediadores (ET-1 e PGE₂) (Verri et al., 2008). Outros confirmaram que a IL-33 induz a produção de IFNγ e sua participação na artrite (Smithgall et al., 2008; Borgeois et al., 2009). A IL-33 também medeia outras respostas como a migração de neutrófilos para a cavidade articular em modelo de artrite. É interessante que em camundongos imunizados há maior expressão de ST2 em neutrófilos, o que possibilita a sua quimioatração pela IL-33. De forma semelhante, pacientes com artrite tratados com metotrexato + anti-TNF tem expressão reduzida de ST2 nos seus neutrófilos, o que não ocorre em pacientes tratados somente com metotrexato. Isso sugere que o TNF seria importante para tornar neutrófilos responsivos à IL-33 e assim serem quimioatraídos. Realmente, neutrófilos de camundongos TNFR1 deficientes não são quimioatraídos pela IL-33 e o oposto ocorre com neutrófilos de camundongos e de pacientes tratados in vitro com TNFα. Assim, a diminuição da expressão de ST2 em neutrófilos e assim a redução da quimioatração pela IL-33 parece ser um novo mecanismo de terapias anti-TNF (Verri et al., 2010). Também é importante mencionar evidências demonstrando que animais deficientes para IL-33 não apresentaram redução da inflamação articular induzida pela administração de soro de camundongos K/BxN (Martin et al., 2013) e que nesse mesmo modelo de artrite passiva, a IL-33 teria o papel de induzir a expansão de basófilos produtores de IL-4 a qual induz o aumento da expressão do receptor Fc inibitório FcGRIIB em macrófagos, resultando na redução da inflamação (Antony et al., 2013). Existem várias possibilidades para explicar esses dados que se opõem a outros dados da literatura como os próprios autores discutiram (Martin et al., 2013).

A IL-33/ST2 também medeia a inflamação cutânea induzida por PMA por ativar mastócitos e recrutar neutrófilos para a pele, bem como sua expressão é aumentada em amostra de pacientes com psoríase em comparação a voluntários saudáveis (Hueber et al., 2012). Indicando um papel terapêutico da IL-33, em um modelo encefalomielite em camundongos (EAE), o tratamento com IL-33 reduziu a produção de IL-17 e IFNγ e aumentou a produção de IL-5 e IL-13 com a polarização de macrófagos para um perfil M2, e a transferência adotiva desses macrófagos M2 polarizados pela IL-33 reduziu a gravidade da EAE (Jiang et al., 2012). De fato, o papel da IL-33 nas respostas M2 (mais abaixo) e Th2 é bem proeminente. Um exemplo da complexidade das suas atividades é que na presença de antígeno, a IL-33 induz a polarização de linfócitos de camundongos e humanos T CD4(+) numa sub-população que produz IL-5, mas não IL-4. Esse mecanismo não depende de STAT6, IL-4, GATA3 ou T-bet, mas depende de MyD88, MAP quinases e NFκB. Como resultado, a IL-33 induz inflamação pulmonar independentemente da IL-4 (Kurowska-Stolarska et al., 2008). Dessa forma, o que parece é que dependendo do ambiente de citocinas e polarização celular, a IL-33/ST2 pode ter funções diversas.

A IL-33 é tida como uma citocina importante na ativação de mastócitos e em doenças relacionadas a essa ativação. Nesse sentido, a IL-33 potencia a produção de moléculas pró-inflamatórias como TNFα, IL-6, IL-13 e quimiocinas dependente de mecanismos intracelulares ativados por antígeno em mastócitos como NFAT, AP-1, NFκB, e MAP quinases JNK e p38 (Andrade et al., 2011). Assim, além de ativar mastócitos, a IL-33 também potencia a atividade de antígeno nos mastócitos. Por outro lado, um dado recente demonstra que a ativação de mastócitos pela IL-33 pode ser uma função aguda, mas que por períodos mais prolongados, a IL-33 reduz a resposta de mastócitos à antígenos por um mecanismo MyD88-dependente com diminuição dos fenômenos induzidos por antígeno como a reorganização do citoesqueleto dos mastócitos e diminuição da mobilização de cálcio. Dessa forma, a IL-33 teria, na realidade, um papel protetor (Jung et al., 2013).

A IL-33/ST2 não participa apenas em respostas imunes adaptativas, mas também em respostas imunes inatas. Em modelo de sepse induzida pela ligadura e perfuração do ceco, a IL-33 tem papel importante reduzindo a internalização de receptores CXCR2 induzida pela ativação da GRK2 pelo LPS em neutrófilos. A internalização dos receptores CXCR2 induzida pelo LPS resulta na redução do recrutamento dos neutrófilos para o foco inflamatório primário e assim, permite a proliferação bacteriana. Por outro lado, a IL-33 ao inibir a expressão de GRK2 induzida pelo LPS, permite que os neutrófilos continuem expressando CXCR2 e sejam quimioatraídos para o foco inflamatório. Corroborando esses dados, pacientes com sepse que não sobreviveram a sepse, apresentaram aumento nos níveis de sST2 comparados aos que sobreviveram (Alves-Filho et al., 2010). Voltando ao papel da IL-33/ST2 na dor, demonstramos recentemente sua participação na resposta imune inata induzida pela carragenina em camundongos. A sinalização IL-33/ST2 é importante para a indução da produção de moléculas pró-hiperalgésicas e edema na inflamação induzida pela carragenina como TNFα, IL-1β, CXCL1, ET-1 e PGE2, além de potenciar a inflamação e produção de mediadores pela carragenina (Zarpelon et al., 2013). Em modelos com administração de estímulos que induzem comportamentos de dor manifesta como ácido acético, fenil-p-benzoquinona (Magro et al., 2013) e formalina (Magro et al., 2013; Han et al., 2013) também há redução da dor pela deficiência de ST2 ou tratamento com anti-ST2, ou aumento pela administração de IL-33 (Magro et al., 2013; Han et al., 2013). Em modelo de isquemia e reperfusão intestinal, o tratamento com ST2 solúvel reduziu a produção de TNFα local e sistêmica, a permeabilidade vascular, infiltrado neutofílico e hemorrágia com aumento na taxa de sobrevivência dos camundongos. O mecanismo foi relacionado ao aumento de IL-10 (Fagundes et al., 2007).

Recentemente foi demonstrado pelo grupo do Prof. João S. Silva (FMRP-USP) que na infecção por Coxsackievirus B 5 (CVB5), camundongos deficientes para ST2 desenvolveram pancreatite mais grave com maior perda de peso e carga viral em relação aos controles. Por outro lado, o tratamento com IL-33 atenuou a pancreatite por aumentar a degranulação e produção de IFNγ e TNFα por linfócitos CD8(+) e células NK que contribuem para eliminação do vírus ao passo que a IL-33 também induziu a produção de IL-4 por mastócitos resultando na diferenciação de macrófagos para M2 e células T reguladoras reduzindo a inflamação na pancreatite (Sesti-Costa et al., 2013).

A IL-33, portanto parece atenuar os efeitos anti-inflamatórios em respostas mediadas por células T e que o eixo IL-33/ST2 pode ser explorado como um alvo terapêutico potencial no tratamento de doenças mediadas pelo sistema imunológico.

Waldiceu A Verri Jr. – Universidade Estadual de Londrina

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Sobre rãs e homens

A revista Science (340:1156 e 1183)  de 7 de junho passado, distribuída entre os membros da Gordon Conference sobre desenvolvimento, publicou uma seção intitulada “Mistérios do Desenvolvimento” com sub-seções encabeçadas por perguntas realmente misteriosas: “Como os órgãos sabem que atingiram o tamnaho certo?” “Por que tantos neurônios comitem suicídio durante o desenvolvimento cerebral?”  “De que maneiras micróbios participam do desenvolvimento animal?” “Como o desenvolvimento fetal influencia a saúde do adulto?” Desde que temas tão básicos continuam a fazer parte de discussões sobre o desenvolvimento, decidi contribuir com um ensaio de pesquisadores de Mill Hill (Londres) (“De rãs e homens”) que, embora escrito em 2000, é muito lúcido e informativo para gente como nós imunologistas que não lidam (ainda) com assuntos dete tipo. Havia traduzido o ensaio para uso de estudantes de graduação e forneço a minha tradução.

Nelson Vaz

 A coleção de ensaios de Mill Hill contém numerosos temas que de  interese geral. 

5/11/13 Mill Hill Essays | MRC National Institute for Medical Research, London
www.nimr.mrc.ac.uk/mill-hill-essays/of-frogs-and-men 1/2

Sobre rãs e homens

Tyger Tyger burning bright, 

In the forests of the night; 

What immortal hand or eye,

Dare frame thy fearful symmetry?

William Blake (1757‑1827)

A ideia de que cada um de nós surgiu de um único, minúsculo ovo tem sido há muito uma fonte de inspiração igualmente para artistas e cientistas. Os eventos que transformam o ovo fertilisado em um indivíduo perfeitamente formado tem provocado espanto e fascinação em igual medida e talvez não seja surpreendente compreender que o desenvolvimenrto embrionário tem sido o principal deafio da biologia moderna. Seu estudo resultou em descobertas que iluminaram muitos ramos diferentes da biologia, desde o estudo da evolução até a natureza de doenças genéticas. Enquanto os métodos utilizados por cientistas têm variado com o progresso, muitas vezes avanços decisivos surgiram do estudo de um tema familiar: os girinos de rãs que muitos de nós lembramos de haver coletado em águas da vizinhança.

Admite-se em geral que o corpo humano contém cerca de duzentos tipos diferentes de células, cada um especialisado no desempenho de funções diferentes. Quase todos estes tipos celulares são formados durante odesenvolvimento embrionário. A pergunta mais simples e profunda que os biólogos procuram responder é: como surge esta diversidade de tipos celulares? Em outras palavras, desde que todas as células de um embrião se originam de repetidas divisões de um único ovo fertilisado, o que determina o destino de uma célula embrionária individual?

Quem quer que seja que tenha observado o desenvolvimento de um ovo de rã através de uma lente terá testemunhado como os embriões se transformam rapidamente de conglomerados ou bolinhas de células aparentemente similares em estruturas complexas contendo tecidos diferentes e possuindo uma forma cada vez mais reconhecível. Que esta transformação notável ocorra com tamanha precisão e previsibildade cada vez que um embrião se desenvolve, sugere que cada célula “sabe” qual é o seu destino de maneira confiável. Se cada célula já sabe a qual tecido ou órgão ela contribuirá para formar, ou, se ela “aprende” sobre seu destino como resultado de sua posição no embrião, é uma pergunta que intrigava os filósofos da natureza muito antes do surgimento da biologia experimental. Em um extremo, podemos imaginar que, de alguma maneira,  o plano corporal inteiro está preformado no ovo fertilizado, e que as divisões celulares distribuem adequadamente os destinos das células filhas. A visão alternativa é de que as células “aprendem” seu destino durante o curso do desenvolvimento incial do embrião, através de interações com células vizinhas e com o meio. Em vez de seguir independentemente instruções originais herdadas do ovo, as células no embrião em desenvolvimento  poderiam interagir com células vizinhas, e esta comunicação poderia suprir a base do estabelecimento de seu futuro destino.

Não é possível distinguir entre estas duas possibilidades pela simples observação e os embriologistas do último século procuraram em vez disso testar a importância da vizinhança celular, quer removendo células de embriões recentes, ou deslocando-as de uma parte do embrião para outra. Tais experimentos requeriam embriões que fossem grandes o bastante para tornar possível micro-cirurgias e também suficientemente robustos para sobreviver a estes procedimentos. Além disso, os embriões deveriam estar disponíveis em quantidade desde os estágios iniciais do desenvolvimento. Embriões precoces de mamíferos eram de pouca utilidade por serem muito pequenos e estarem escondidos nas entranhas da mãe. Até mesmo embriões de pinto eram de pouca utilidade desde que se sabia que os estágios iniciais do desenvolvimento ocorrem antes que o ovo seja posto. En contraste, os ovos de rãs são grandes e numerosos. Além disso, protegidos em sua capa gelatinosa individual, eles atravessam o curso total de seu desenvolvimento externamente na água do brejo, da fertilização do ovo a formação dos girinos que nadam. Não supreende, portanto, que embriões de anfíbios se tornaram rapidamente os objetos favoritos de embriologistas experimentais.

Uma característica óbvia da reprodução das rãs é que os ovos recém postos são de tamanho similar aos girinos aos quais dão origem. Todos os nutrientes necessários ao desenvolvimento embrionário inicial já estão presentes dentro do ovo fertilizado, guardado  na forma de moléculas de proteínas da gema (yolk). Quando o ovo se divide, cada célula filha recebe a metade deste estoque de nutrientes, e o processo é repetido a cada divisão celular sucessiva. Como resultado, ao contrário dos embriões de mamíferos e aves, os embriões de anfíbios não crescem realmente. Até que o girino comece a se alimentar, todas as divisões celulares simplesmente cortam a célula ao meio. Enquanto o número de células em um girino está talvez na ordem de cem mil, a 

massa do girino é a mesma que a do ovo fertilizado, e permite processos metabólicos talvez ligeiramente menores que o ovo fertilizado.

Uma consequência disso é que se células individuais são marcadas com um corante não-tóxico, a cor será herdada pelas células filhas sem se desbotar (muito) e permanecerá detectável muito mais tarde no desenvolvimento. Com esta técnica simples, embriologistas  construiram mapas detalhados que descrevem o destino de diferentes células e regiões do embrião inicial de anfíbios. A ausência de crescimento tem outras vantagens para o experimentador. Desde que as células contêm os nutrientes necessários, elas continuarão a se dividir em um meio de cultura, que não precisa ser mais que uma solução salina simples. Isto possibilitou um teste para prever em que estágio as células embrionárias demonstram “saber’ o seu destino. Se, depois de removidas do embrião, elas continuam a formar as células ou tecidos previstos pelo “mapa de destinos”, no momento em que foram colocadas no meio de cultura, tais células já “sabiam” sua posição no futuro plano corporal. Por outro lado, se sua especialização falha e não tem o resultado esperado, isto sugere que as células ainda não “sabiam” seu destino normal. Estudos desta tipo formaram a base da embriologia experimental e permanecem na base da pesquisa até hoje.

Por experimentos deste tipo sabemos que, em grande parte, os padrões complexos de especialização celular vistos no embrião de anfíbios não surgem da atividade autônoma de células individuais, programadas para “saber” o seu destino em virtude de sua linhagem de descendência a partir do ovo fertilizado. Ao contrário, estes padrões dependem criticamente de sinais trocados entre células vizinhas. Estas interações estabelecem um esboço do plano corporal do embrião, que é progressivamente sofisticado à medida que o embrião se desenvolve. A aquisição gradual de “padrões” de identidade celular é suficientemente precisa de forma que seus resulatdos sejam praticamente idênticos cada vez que se desenvolve um embrião de uma espécie em particular. Ainda assim, como os experimentadores logo constataram, (o processo) é suficientememte flexível para acomodar variações naturais ou experimentalmente induzidas tanto no tamanho quanto na estrutura de embriões individuais.

Estudos subsequentes do desenvolvimento embrionário em espécies que vão de peixes a mamíferos mostraram que mecanismos similares estão na base do desenvolvimento em todos os vertebrados. O objetivo de biólogos do desenvolvimento  tem sido identificar a natureza dos sinais trocados entre as células do embrião inicial e como eles encaminham as células atráves de um trajeto particular de desenvolvimento. Notavelmente, ao passo que aprendemos sobre a natureza das moléculas envolvidas nesta sinalização, tornou-se claro que mecanismos básicos similares guiam o desenvolvimento embrionário em criaturas tão diversas quanto moscas e seres humanos.  Em resumo, podemos confiar em que as lições aprendidas pelo estudo do embrião de rãs avançarão nosso conhecimento sobre o desenvolvimento do embrião humano.

Antes da Segunda Guerra Mundial, a maioria dos embriologistas estudava embriões convenientemente obtidos de espécies de anfíbios locais. Os embriões de salamandras eram particularmemte atraentes, devido a seu tamanho e seu ritmo lento de desenvolvimento. Qualquer que fosse a espécie usada, o suprimento de embriões era naturalmente limitado pelo período natural de reprodução e, na medida em que as análises bioquímicas se tornaram populares, a demanda de embriões cresceu.  Felizmente, em 1931, no curso de alguns experimentos endocrinológicos, foi achado que extratos da hipófise anterior induziriam a postura de ovos pela rã sul-africana Xenopus.  Constatou que o agente ativo era o hormônio luteinizante produzido por mamíferos durante a gravidez e excretado na urina. Esta descroberta teve várias consequências. Primeiro, levou ao desenvolvimento de  um teste de gravidez, baseado na injeção de extratos de urina em rãs fêmeas. Como resultado, grande número de Xenopus foram usados em laboratórios, criando o temor de que a espécie silvestre fosse dizimada. Felizmente, métodos imunológicos mostraram ser mais sensíveis para a detecção do hormônio luteinizante e o teste com Xenopus foi abandonado. Seu legado, contudo, foi estabelecer o Xenopus como um animal comum de laboratório e, para os biologistas do desenvolvimento, a capacidade de induzir a postura de ovos em qualquer época do ano tornou o Xenopus o anfíbio de escolha para experimentos em embriologia.

Aqui em nosso Instituto (Mill Hill, London) os Xenopus foram inicialmente utilizados para estudar como nervos individuais se conectam a tecidos alvo, usando o desenvolvimento do sistema visual de girinos como um modelo.  Pesquisas sobre as ações de hormônios esteróides levaram a estudos da metamorfose. As profundas mudanças que transformam um girino em uma rã mostraram estar sob o controle de hormônios da tireóide. Um fenômeno destacado na metamorfose é a perda da cauda do girino, que resulta da morte celular desencadeada por hormônios. Estes estudos levaram à criação de uma colônia de Xenopus laevis em nosso Instituto possibilitando outros cientistas a se juntarem ao grupo de estudo do desenvolvimento de anfíbios. Outros estudos pioneiros com Xenopus se concentraram na padronização espacial em embriões jovens. Usando microcirurgias para interferir com o desenvolvimento normal, estes estudos foram centrais em entender como blocos de tecido muscular são formados nos primeiros dois dias do desenvolvimento embrionário. Os “blocos” visíveis de músculos se formam ao longo do dorso do embrião, de cada lado da coluna vertebral embrionária. Eles se formam progressivamente da cabeça à cauda em um ritmo preciso e em número exato. Procurou-se um mecanismo que pudesse arcar com esta precisão por interferências com sua formação. Como ocorre muitas vezes, as conclusões deste trabalho tiveram implicações mais amplas para a biologia do desenvolvimento desde que muitas outras estruturas do embrião de vertenbrados mostram evidências de um padrão repetitivo similar e cientistas em todo o mundo buscam identificar os sinais moleculares responsáveis pelos mesmos.

Vimos que o destino de diferentes regiões do embrião inicial de Xenopus pode ser previsto com precisão e, ainda mais, que em virtude de seus estoques de nutrientes, fragmentos do embrião podem ser mantidos isolados em cultura de tecidos. Os embriologistas rapidamente perceberam que estas propriedades forneciam uma maneira simples de testar e identificar as moléculas sinalizadoras. Extratos específicos ou moléculas purificadas podem ser adicionadas ao meio de cultura e testadas em sua capacidade de alterar o destino de células embrionárias no desenvolvimento. Exatamente esta abordagem foi usada pelo embriologista germânico Tiedemann ao mostrar que um extrato de embrião de pinto com 10 dias poderia fazer com que células que futuramente dariam a pele fossem reencaminhadas como células que formavam músculos e a coluna dorsal do embrião. Este resultado espantoso mostrou que fatores indutores podiam realmente derivar de tecidos embrionários. Infelizmente, a natureza do teste tornou praticamente impossível um estudo sistemático e pouco progresso foi feito no isolamento dos fatores envolvidos.

Um exemplo similar de sinalização entre células foi também descrito com embriões de anfíbios. Com 5 horas de desenvolvimento, o embrião de rã é pouco mais que uma bolinha com alguns milhares de células, com uma cavidade interna em sua metade superior. A partir de mapas do desenvolvimento sabemos que as células que formam o teto desta cavidade normalmente formarão a pele e o tecido nervoso, enquanto que as células do polo oposto gerarão o intestino e o fígado. As células intermediárias, formando uma faixa em volta do equador do embrião, contribuirão para formar músculos, os rins e a coluna vertebral. O embriologista de anfíbios Pieter Nieuwkoop demonstrou elegantemente que sanduíches de células dos dois polos recriavam um tecido similar à faixa equatorial. Em outras palavras, os tecidos “futuros” pele e nervo originários do teto da cavidade embrionária eram redirigidos a formar músculos, rins e coluna vertebral  pelo contato como tecido do fundo da cavidade embrionária, que geram os “futuros” intestino e fígado. Com um suprimento abundante de embriões para preparar extratos, pesquisadores em vários laboratórios se propuseram a identiificar as moléculas sinalizadoras que o trabalho de Nieuwkoop mostrou estarem presentes.

Pesquisa bem sucedias na identificação do fator de Nieuwkoop começaram em 1984. Porém, a fonte da atividade sinalisadora finalmente identificada não veio de um extrato de embriões, mas sim de um tipo de célula de Xenopus que originalmente foi obtida de girinos, mas que tem sido cultivada em muitos laboratórios há muitos anos. Quando células prospectivas de pele de embriões de 5 horas foram postas em contato com uma camada destas células cultivadas, as células embrionárias foram redirigidas a formar tecido muscular. Na verdade, simplesmente por exposição das células embrionárias ao flúido no qual tais células foram cultivadas, era suficiente para induzir a formação das células musculares. Significativamente, isto mostrou que o fator sinalizador era secretado para o meio e poderia, em princípio, ser purificado. Mas isto foi mais fácil dizer do que realizar, em parte porque a atividade era muito potente. Depois de três anos de esforços, cento e sessenta e cinco litros de flúido de cultura forneceram 1,6 milionésimos de grama de uma proteína pura. Colegas na quimica de proteínas em nosso instituto a identificaram como um hormônio chamado ativina.

A ativina já era conhecida dos endocrinologistas como um hormônio responsável pela produção, na hipófise, de outro hormônio chamado estimulador de folículos (FSH), que é necessário para a maturação e liberação de óvulos pelo ovário de mamíferos. Este novo resultado foi a primeira indicação de que a ativina poderia estar também envolvida no desenvolvimento embrionário. Igualmente importante, talvez, a ativina se tornou uma potente ferramenta experimental para estudar o mecanismo pelo qual eram estabelecidas as células da faixa equatorial do embrião, coletivamente chamadas de mesoderma pelos embriologistas. Permanecia incerto se a ativina, em si mesma, era realmente a molécula sinalizadora ou se ela mimetizava fortuitamente um fator sinalizador. No entanto, estudos subsequentes identificaram várias outras proteínas presentes em fases inicias dos embriões que são relacionadas à ativina e possuem propriedades similares. Mapas do desenvolvimento demonstram que a região equatorial do embrião inicial forma diferentes tipos de tecidos mesodérmicos de maneira regular. Células equatoriais de um lado do embrião formam a coluna vertebral embrionária, células adjacentes formam músculos e células do outro lado formam os rins. 

Se todos os tipos de células mesodérmicas são induzidas pela ativina, como explicar esta padronização? Este tipo de problema já foi considerado anteriormente no trabalho de colegas nossos na Middlesex Hospital Medical School, que propuseram que uma única molécula sinalizadora poderia ter efeitos diferentes em células alvo, dependendo de sua concentração. Exatamente este efeito foi demonstrado para a ativina.  Concentrações baixas de ativina tendem a induzir tecidos como os rins e o sangue, normalmente formados pelo lado ou ventre do girino. Concentrações mais altas formam tecidos do dorso do girino, tais como músculos e a coluna vertebral.

De que maneira moléculas como a ativina alteram o destino celular? Com o advento da biologia miolecular tornou-se possível colocar esta pergunta em termos mais específicos.  Quando as células se especializam, eslas começam a produzir certos tipos de proteínas necessárias à sua função. particular. Células musculares, por exemplo, farão todas as proteínas necessárias à contração de fibras musculares, juntamente com aquelas necessárias para prover a energia requerida pela contração muscular. Elas fazem isto ativando o conjunto apropriado de genes que codificam estas proteínas. Os sinais que dirigem uma célula embrionária em uma dada direção precisam, portanto, modificar o padrão de genes ativados pela célula, ativando alguns e talvez inibindo outros. Estas mudanças não parecem se dar em um único passo, parecem ser estabelecidas em série, com alguns genes codificando proteínas que regulam outras mais abaixo em uma hierarquia sequencial. O resultado final é a diferenciação de um tipo célular especializado que é geralmente irreversível.

Desde a perspectiva da biologia molecular, as células “sabem” seu destino eventual quando sinais gatilham estas cascatas de mudanças na expressão gênica. Compreender de que maneira sinais como a ativina estabelecem mudanças no destino celular significa identificar os genes em cada passo do processo. Isto agora se tornou um objetivo viável e, novamente, experimentos com embriões de anfíbios forneceram avanços decisivos.

Uma maneira de testar o papel de um gene particular no desenvolvimento é averiguar qual o efeito da proteína que o gene codifica sobre células que normalmente não a sintetizam. Embriões de Xenopus se prestam a este tipo de experimentos. Ácidos nucleicos clonados codificando a proteína podem ser colocados por microinjeção no embrião, fazendo com que a proteína seja produzida em todas as células injetadas e seus descendentes. Os métodos de clonagem do DNA podem ser usados para alterar o DNA a ser injetado de forma que as células do embrião agora fazem uma proteína mutante. Este mutante pode ser uma forma super-ativa da proteína, mas também pode adotar uma forma que inibe a função da proteína normal. Examinado o efeito de versões mutantes e normais de um produto gênico no desenvolvimento embrionário, podemos começar a identificar o papel que ele desempenha no desenvolvimento. Por exemplo, sabemos agora identificar uns poucos genes que são ativados nos precursores de células da pele por exposição à ativina, Um destes genes, chamdo Bracyury, codifica uma proteína que, por si só, pode desencadear células embrionárias indecisas a formar músculo ou notocórdio. Isto sugere que a síntese da proteína Brachyury é um evento bem precoce no trajeto desenvolvimental que conduz a estes tipos celulares. Consistente com esta ideia, a proteína parece se ligar ao DNA, controlando a ativação de outros genes que atuam adiante no trajeto do desenvolvimento.

Como podemos nos assegurar que um gene que identificamos realmente desempenha o papel que lhe atribuímos neste tipo de estudos? Um modo simples é averiguar o efeito que a remoção do gene terá no desenvolvimento normal. Mutaçãoes que têm algum efeito podem ser induzidas ao acaso no material genético, por tratamento químico ou exposição a radiações. Mutantes individuais podem então ser identificados para outros estudos, por pesquisas através do embriões identificando aqueles que fracassam em desenvolver um órgão particular ou um tecido de interesse. Esta abordagem foi usada antes por geneticistas usando drosófilas,  mas foi aplicado mais recentemente ao desenvolvimento de vertebrados usando embriões do peixe paulistinha (Zebra fish). Uma estratégia alternativa é a mutação seletiva de genes individuais por engenharia genética, um procedimento que se tornou bem estabelecido no estudo do desenvolvimento de embriões de camundongo. Seja a mutação ao acaso ou dirigida, um aspecto crucial de cada método é a capacidade cruzar e manter populações para cada mutação genética individual. Isso mostrou ser impossível com o Xenopus laevi, não apenas porque ele leva um ano ou mais para atingir a maturação sexual a partir de embriões. No entanto, rãs da espécie relacionada Xenopus tropicalis podem cruzar em menos de 4 meses, e parecem reter muitas senão todas as vantagens evidentes em seus primos de desenvovimento mais lento. A combinação de abordagens genéticas, moleculares e embriológicas para estudar as fases iniciais do desenvolvimento em um único vertebrado é uma possibilidade poderosa e entusiasmante.