Journal Club IBA: The receptor NLRP3 is a transcriptional regulator of Th2 differentiation.

A família de proteínas NLR é fisicamente caracterizada por conter dois domínios principais básicos em sua estrutura: um domínio NOTCH (ligação à nucleotídeos) e um domínio LRR (região repetitiva de leucinas). Estes domínios se associam com outros domínios variáveis para formar cada uma das moléculas que compõe esta família. Cada proteína NLR exerce funções específicas na célula, podendo atuar como receptors para o reconhecimento de PAMPs e DAMPs, sinalizadores intracelulares, moduladores de funções nucleares, entre outros. A molécula NLRP3 pertence à família NLR e é amplamente conhecida como um PRR citosólico ativado por diversos ligantes produzidos em situação de perigo para a célula. A interação do NLRP3 com o estímulo intracellular promove uma alteração conformacional na estrutura deste PRR que induz a oligomerização de diversas unidades, formando o inflamassoma. A formação do inflamassoma induz uma cascata de reações que irão culminar na liberação das citocinas inflamatórias IL-1b e IL-18, capazes de modular a resposta imunológica. A atividade do NLRP3 nas células da resposta immune inata tem sido amplamente explorada em diversos contextos fisiopatológicos. Porém, o mesmo não pode ser dito a respeito de sua influência na resposta immune adaptativa. Apenas alguns trabalhos tem demonstrado que há influência do NLRP3 na diferenciação diferenciação de células T auxiliares (Th) para os diferentes perfis imunológicos, porém os resultados ainda são controversos.

Buscando entender como a molécula NLRP3 afeta o destino das células T, Bruchard e colaboradores (2015) realizaram experimento de diferenciação de Th in vitro, no qual foi possível observar que a expressão de Nlrp3 foi induzida 12 horas após a diferenciação em Th0 (anti-IFN-γ + anti-IL-4), Th1 (anti-IL-4 + IL-12) e Th2 (anti-IFNγ + IL-4), com auxílio de anti-CD3 e anti-CD28 para estímulo do TCR, enquanto que em células naive sua expressão não foi detectada. Utilizando células T CD4⁺ Nlrp3^-/^- após 3 dias de diferenciação para Th1 foi constatado que a expressão do mRNA de Ifng e do fator de transcrição T-bet não foram alterados por tal deficiência quando comparados às células WT, mas células diferenciadas para Th2 tiveram a expressão de Il4 alterada, mas somente uma pequena diminuição da expressão do fator de transcrição GATA-3. Além disso, células T CD4⁺ Nlrp3^-/^- tiveram expressão diminuição da expressão de genes ligados ao perfil Th2, tais como Il5, Il13, Gata3, Ccr3, Ccr4 e Maf,

            Com o intuito de desvendar o mecanismo comum que controla a indução de NLRP3 em células T CD4⁺, os autores formularam a hipótese de que a indução de NLRP3 seria mediada pelo estímulo do TCR e subsequente liberação de IL-2, necessária para diferenciação de células Th0, Th1 e Th2. O uso de um anticorpo para bloquear IL-2 impediu completamente a habilidade da ativação do TCR de induzir expressão de Nlrp3 em células T CD4⁺, confirmando a hipótese proposta. Além disso, a inibição de STAT5, fator de transcrição clássico downstream ativado pela sinalização de IL-2 utilizando RNAi aboliu a habilidade da sinalização pelo TCR de induzir a expressão de Nlrp3 em células T CD4⁺. Tais resultados indicaram a possibilidade de STAT5 ser capaz de controlar a expressão de Nlrp3, sendo que análises de bioinformática identificaram um sítio de ligação para STAT5 na região promotora de Nlrp3 e ensaio de ChIP em células T CD4⁺ ativadas confirmou essa predição.

            Sabendo que NLRP3 está intimamente relacionado ao inflamassoma, os autores compararam a expressão gênica e níveis proteicos de IFN-y e IL-4 produzidos em células T CD4⁺ WT e T CD4⁺ Casp1^-/^- ou Asc^-/^-, polarizadas para Th1e Th2, sendo possível observar que as moléculas ASC ou caspase-1 não são necessárias para polarização de células T CD4⁺, pois não afetaram a expressão gênica e níveis proteicos de IFN-y e IL-4. Além disso, foi observado que o estímulo do TCR sozinho ou em conjunto com nigericina e ATP (ativadores conhecidos do inflamassoma de NLRP3) não foi capaz de ativar caspase-1 e tampouco induzir a liberação de IL-1β ou IL-18 em células Th2 diferenciadas. Os autores realizaram experimentos in vivo, utilizando animais Casp1^-/^-, Asc^-/^- ou Nlrp3^-/^- e vacinação com OVA + lipopeptídeo Pam3SK4 (ligante de TLR2), sendo que somente os animais Nlrp3^-/^- tiveram a polarização para Th2 prejudicada, determinada pela concentração de IL-4 no soro. Tais resultados demonstram que somente NLRP3 está ligado à resposta Th2, controlando o programa transcricional para Th2 de forma independente da ativação de inflamassoma, in vivo e in vitro.

            Com base nos resultados obtidos, especulou-se que NLRP3 pudesse agir em proteínas nucleares envolvidas na regulação transcricional de Th2, fato que foi confirmado pela identificação da localização nuclear de NLRP3 em células Th2, em contraste com a localização citoplasmática em células Th1 e Th2 Nlrp3^-/^-. A molécula responsável pela localização nuclear foi a importina Kpna2, identificada com ensaio de RNAi, sendo que a sua ausência impediu a localização nuclear de NLRP3 e também a polarização para Th2, medida pela produção de IL-4.

Os autores então cogitaram a possibilidade de que NLRP3 pudesse agir como fator de transcrição em células Th2, fato que foi confirmado com as observações de que as 218 regiões de ligação de NLRP3 identificadas por ChIP-Seq em células Th2 estavam relacionadas à genes de expressão diminuída em experimento de RNA-Seq em células Nlrp3^-/^-. Além disso, a ligação de NLRP3 ao DNA na sequência predita por ChIP-Seq foi confirmada com ensaio de precipitação de DNA.

Utilizando ensaio de repórter de luciferase foi observado que NLRP3 sozinho não consegue induzir a ativação do promotor de Il4, levando à hipótese de que outro fator de transcrição seria necessário. Com o auxílio de experimento de ChIP-Seq foi possível observar que NLRP3 e IRF4 compartilham picos de ligação na região promotora de Il4, sendo que a interação entre NLRP3 e IRF4 no núcleo de células Th2 foi confirmada utilizando ensaio de proximidade de ligação.

            Como forma de testar a relevância das observações anteriores, foi utilizado modelo animal de asma alérgica induzida por OVA, onde animais Nlrp3^-/^- demonstraram menor infiltrado de eosinófilos e linfócitos no pulmão, níveis mais baixos de IL-4 e IL-5 e maior acúmulo de muco, apresentando uma versão mais branda da doença. Mas em contrapartida, assim que os animais Nlrp3^-/^- receberam células Th2 WT específicas para OVA, isso foi o suficiente para restaurar o infiltrado de eosinófilos e linfócitos no pulmão, além do aumento da produção de IL-4 e IL-5. Foi utilizado também modelo experimental de câncer de pulmão utilizando células B16F10, modelo conhecido por levar à indução de citocinas Th2. Camundongos Nlrp3^-/^- apresentaram crescimento do tumor impedido, quando comparados aos animais WT. Além disso, animais Casp1^-/^- ou Asc^-/^- apresentaram crescimento normal da massa tumoral, demonstrando que o efeito de impedimento do crescimento do tumor é independente da ativação de inflamassoma.

            De maneira geral, pode-se concluir que NLRP3 apresenta funções de fator de transcrição, além de ser capaz de interagir com IRF4 e se ligar ao DNA em células T CD4⁺ para controlar a polarização de perfil Th2.

Figura 1.  A ativação do TCR em células T CD4⁺ leva à liberação de IL-2, que ativa o fator de transcrição STAT5, que leva à indução de NLRP3. NLRP3 é capaz de agir como fator de transcrição, de forma conjunta com IRF4, levando à ativação do promotor de Il4 e a polarização desta célula para um perfil Th2 produtor de IL-4. Além disso, esse mecanismo foi confirmado em modelos experimentais de asma e câncer.

Post de Andressa Fish e Taís Arns (doutorandas FMRP-USP/IBA)