Imunologia molecular In silico – Parte III

 Clusterização Hierárquica e Reatividade Cruzada

A reatividade cruzada de Linfócitos T Citotóxicos (CTLs) é um fenômeno no qual uma mesma população de células CD8+ é capaz de reconhecer e responder contra dois ou mais alvos distintos (um mesmo TCR interage fortemente com mais de um complexo peptídeo:MHC). Esta característica dos CTLs tem aplicações diretas no desenvolvimento de vacinas e em outras áreas da imunologia. Conforme revisado na primeira parte deste post, houve algumas iniciativas de predição de reatividade cruzada baseadas nas sequências dos peptídeos apresentados (Frankild, 2008; De Groot, 2013), mas a compreensão e predição destes padrões de resposta têm se mostrado um desafio muito complexo.

Em um estudo publicado em 2008, uma equipe coordenada pelos pesquisadores alemães Heiner Wedemeyer e Markus Cornberg imunizou um indivíduo saudável com a vacina experimental IC41 (Fytili e cols., 2008). Esta vacina continha um epitopo imunogênico da proteína NS3 do Vírus da Hepatite C (HCV-NS3₁₀₇₃), cuja sequência de aminoácidos era “CINGVCWTV”. Conforme esperado, a vacina induziu a geração de CTLs específicos para este alvo. Em seguida, os pesquisadores recuperaram estes linfócitos e os desafiaram in vitro contra 28 variantes naturais do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, cobrindo os seis genótipos de HCV. A resposta contra a sequência selvagem “CVNGVCWT” do Genótipo 1 (G1-01), que apresenta alta reatividade cruzada com o epitopo vacinal, foi considerada o controle positivo. De acordo com os autores, foi observada uma importante reatividade cruzada com os alvos dos genótipos 4, 5 e 6, bem como com algumas variantes do genótipo 1. Por outro lado, uma fraca resposta foi observada contra os alvos dos genótipos 2 e 3. Em especial, o epitopo G3-18 (“TVGDVMWTV”) foi o único que aboliu completamente o reconhecimento pelos CTLs utilizados no ensaio (Figura 1A).

Figura 1. Comparação entre resultados in vitro e a análise estrutural in silico. (A) Resultados de um ensaio in vitro realizado por Fytili e cols., 2008, no qual uma mesma população de CTLs – específica contra a sequência selvagem do epitopo HCV-NS3₁₀₇₃ - foi desafiada contra 28 variantes naturais deste alvo. (B-I) Recorte da área de interação com o TCR de alguns destes epitopos, no contexto do HLA-A*02:01, após modelagem pela técnica D1-EM-D2 (Antunes e cols., 2010). Áreas carregadas são apresentadas em azul (positivas) e vermelho (negativas), em uma escala de -10 kT a +10 kT. Complexos com forte reatividade cruzada apresentam grande semelhança estrutural (B-E), enquanto complexos com fraca resposta cruzada (F-I) apresentam diferenças no potencial eletrostático (setas verdes). Modificado de Antunes e cols., 2011.

Conforme apresentado na segunda parte deste post, o nosso grupo desenvolveu uma abordagem para a predição estrutural de complexos pMHC e começou a observar a distribuição do potencial eletrostático na superfície destes complexos. Em um trabalho publicado em 2011, foi realizada a modelagem destes 28 complexos apresentando variantes de HCV no contexto do MHC humano HLA-A*02:01 (Antunes e cols., 2011). Observando a superfície destes complexos, ficou clara a semelhança estrutural entre aqueles que apresentavam reatividade cruzada, em termos de topografia e distribuição de cargas (Figura 1B-E). Por outro lado, os complexos com fraca resposta cruzada apresentavam diferenças no potencial eletrostático, o que era especialmente visível no caso do complexo G3-18 (Figura 1I).

Na tentativa de quantificar estas relações de similaridade, nós delimitamos uma região nas imagens dos complexos e extraímos valores relativos ao histograma de cores (RGB). Estes valores foram utilizados como entrada para uma análise de componentes principais (PCA) que foi capaz de reproduzir os agrupamentos observados in vitro (Figura 2). Observe que, de acordo com o PC1 (que explica a maior parte da variabilidade dos dados), foi possível agrupar todos os complexos do genótipo 3 (G3) em um determinada faixa de valores. Os complexos do genótipo 2 ocupam outra faixa, na qual também se encontram os “mau-respondedores” do genótipo 1. Todos os complexos que apresentaram elevada reatividade cruzada se agrupam em uma faixa distinta, dominada pelos complexos do genótipo 6. Nós também incluímos nesta análise um epitopo de Influenza (IV-NA₂₃₁), cuja reatividade cruzada com o HCV-NS3₁₀₇₃ havia sido descrita previamente (Wedemeyer e cols., 2001), observando que o mesmo se localiza ao lado do epitopo selvagem de HCV.

Figura 2. Distribuição dos complexos de acordo com uma Análise de Componentes Principais (PCA). O único complexo que não apresentou resposta in vitro aparece completamente isolado (G3-18). A distribuição de acordo com o PC1 permite observar faixas que agrupam os complexos do genótipo 3 (G3), os complexos do genótipo 2 (G2) e os complexos do genótipo 6 (G6). O epitopo IV-NA₂₃₁, previamente descrito como alvo de reatividade cruzada com o epitopo HCV-NS3₁₀₇₃, também se localizou junto ao grupo G6. Modificado de Antunes e cols., 2011.

        Os mesmos resultados foram observados utilizando-se outra abordagem estatística, a análise de clusterização hierárquica (HCA). O HCA também apresentava algumas vantagens práticas para a análise de um volume maior de dados, fornecendo um dendrograma das relações de similaridade entre os complexos. Foi então realizada uma triagem virtual de 55 complexos pMHC não relacionados, incluindo os pMHCs “cross-reativos” de HCV, mas também vários outros pMHCs disponíveis no CrossTope. Para esta abordagem foram utilizados valores de 7 regiões de variabilidade na superfície do pMHC (compatíveis com os footprints dos TCRs), os quais serviram para agrupar os complexos através do HCA (Antunes e cols., 2011).

Conforme esperado, o dendrograma resultante apresentou um agrupamento principal contendo as variantes de HCV. No entanto, este “cluster de HCV” incluía novos complexos. Dois deles se destacaram pela semelhança estrutural com o HCV-NS3₁₀₇₃: o HIV-GAG₇₇ (SLYNTVATL) e o EBV-LMP2₃₂₉ (LLWTLVVLL). Observe que o epitopo de EBV não compartilha nenhum aminoácido com o epitopo selvagem de HCV e que, no entanto, apresentou uma superfície muito semelhante no contexto do HLA-A*02:01. A possível reatividade cruzada entre HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉ não havia sido descrita e este alvo dificilmente teria sido sugerido por qualquer análise baseada em sequência.

Intrigados por nossa predição, o grupo do Professor Markus Cornberg resolveu testar estes alvos, utilizando estimulação ex vivo de linfócitos de pacientes HCV+ e avaliando o reconhecimento dos peptídeos através da marcação intracelular de Interferon-γ e citometria de fluxo. Estes estudos, ainda não publicados, confirmaram a reatividade cruzada entre os alvos HCV-NS3₁₀₇₃ e EBV-LMP2₃₂₉, apresentando importantes implicações para o estudo da evolução da infecção por HCV (Zhang, S., comunicação pessoal).

Encerramos assim esta jornada pelas pesquisas desenvolvidas pelo Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética (NBLI). Nos próximos posts abordarei outras novidades desta nova fronteira da Imunologia, a “Imunoinformática”. Um Feliz dia dos Namorados a todos (especialmente à Stertz, L.) e boa sorte para a seleção brasileira que estreia hoje no mundial de 2014!!

Post de Dinler Amaral Antunes

NBLI - Núcleo de Bioinformática do Laboratório de Imunogenética.

Aluno de Doutorado do Programa de Pós-Graduação em Genética e Biologia Molecular da Universidade Federal do Rio Grande do Sul (PPGBM/UFRGS).