domingo, 7 de abril de 2013

Journal Club IBA: TCR-CD3: ITAMs Quantity Matters!




Os ITAMs (ImmunoreceptorTtyrosine-based Activation Motif) localizados nas cadeias CD3 associadas ao TCR são críticos para o processo de sinalização desencadeado após a interação entre os complexos TCR:CD3 e MHC:peptídeo (MHCp). A fosforilação de seus resíduos de tirosina gera sítios de ancoramento para tirosina-quinases, principalmente a ZAP-70, iniciando uma cascata de eventos que culminam na ativação das células T. Estes domínios estão amplamente distribuídos entre receptores de células hematopoiéticas, incluindo células T e B, macrófagos e células NK. Contudo, o complexo TCR:CD3 apresenta 10 ITAMs, enquanto os outros receptores não contém mais do que 3. Este grande número de ITAMs provavelmente exerce um importante papel em auxiliar as células T na sua magnífica tarefa de detectar quantidades mínimas de peptídeos estranhos associados ao MHC nas APCs.
Questões que surgem naturalmente a respeito dessa elevada multiplicidade de ITAMs nas células T referem-se à ativação de vias de sinalização específicas, redundância na ativação celular ou existência de efeitos aditivos. Holst e colaboradores (2008), utilizando camundongos retrogênicos que expressavam de 0 a 10 ITAMs funcionais nas cadeias CD3, demonstraram que existe uma relação linear entre o número de ITAMs funcionais e o potencial proliferativo das células T respondedoras, enquanto a capacidade de secretar citocinas como IL-2 e IFN-γ não foi afetada. Esta observação sugere que em algum ponto da sinalização desencadeada pela ativação do TCR, as vias que levam à proliferação celular e à produção de citocinas são dissociadas.
Para avaliar como as células T com baixos números de ITAMs (2 ou 4) mantêm a capacidade de produzir citocina e verificar quais são as vias que requerem alta multiplicidade de ITAMs, Vignali D.A.A. e colaboradores (2013) isolaram células T CD4+ contendo 2, 4 ou 10 ITAMs funcionais para observar essas diferenças.
Como já observado nesse modelo, células com baixa multiplicidade de ITAMs apresentam menor proliferação, o que foi acompanhado com menor expressão de c-Myc, uma proteína que confere sinais de sobrevivência e proliferação. A expressão de c-Myc é regulada por sinais mediados por membros da família de receptores Notch, entre outras vias. Células com baixa multiplicidade de ITAMs apresentam menor expressão de Hes, indicador downstream da ativação de Notch, além de menor quantidade de domínio intracelular ativo (transcriptionally active intracellular domain - NICD), um fragmento observado após ativação do TCR. A indução da expressão de c-Myc por tamoxifeno restaura a capacidade proliferativa das células T com baixa multiplicidade de ITAMs.
Para avaliar o papel de Notch em maiores detalhes, os genes responsáveis por codificar Notch e ADAM10, metaloproteinase responsável pela clivagem da subunidade extracelular de Notch, foram flanqueados com loxP e após transdução com retrovírus contendo Cre-recombinase, esses genes foram deletados. As células que não apresentam Notch ou Adam10 demonstram deficiência na capacidade proliferativa, porém a produção de citocinas não foi alterada. Células que apresentam Notch mutante, incapaz de reconhecer o ligante, apresentam menor expressão de c-Myc, demonstrando que indução de c-Myc mediado por Notch requer a ligação de Notch ao seu ligante.
Sabendo que Notch1 acumula no cSMAC (central supramolecular cluster), os autores avaliaram a formação da sinapse imunológica. Analise temporal da formação da sinapse imunológica mostram que o número de microclusters formados e a velocidade da migração de microclusters foram similares entre células T expressando diferentes quantidades de ITAMs. Porém as células que apresentam baixa multiplicidade de ITAM foram incapazes de contrair, um indicativo de sinapse madura, mesmo após 60 minuto. Esse resultados sugerem que a ausência da formação de cSMAC prejudica a ativação de Notch e expressão de c-Myc.
Um defeito na associação entre TCR e Vav1, proteína envolvida na reorganização do citoesqueleto, foi o responsável pela maturação incompleta da sinapse imunológica em células com poucos ITAMs. ZAP-70 apresenta maior afinidade por resíduos de tirosina fosforilados e requer dois resíduos para a ligação ao TCR, dessa forma essa quinase é capaz de deslocar Vav1 do complexo TCR. Como células com poucos ITAMs funcionais apresentam menor número de resíduos de tirosina, ZAP-70 se liga preferencialmente, o que impede a ligação de Vav1 ao TCR e consequente reorganização do citoesqueleto.
Para determinar quais vias garantem a produção de citocinas, a fosforilação de ZAP-70 e ERK foram analisadas. Tanto as células com alta multiplicidade de ITAM como as células com baixa multiplicidade de ITAMs apresentam similar fosforilação de ZAP-70 e ERK, o que explica por que a produção de citocinas não foi afetada em células com poucos ITAMs funcionais.
Esses resultados sugerem que as vias induzidas pelo TCR que culminam na produção de citocinas e proliferação são divergentes, o que permite ao complexo TCR-CD3 promover funções efetoras limitadas. O programa completo de diferenciação e função de células T pode ocorrer após estimulação ótima do TCR, como observado nas respostas de células com 2, 4 e 10 ITAM a agonistas forte e fraco. Isso habilita o complexo TCR, e talvez outros complexos de receptores de sinalização, a orquestrar uma série de eventos funcionais, fornecendo ao TCR o controle como “reostato” sob a qualidade de resposta efetora.
  
Post  de Mariana Benício e Thaís Bertolini (IBA- FMRP-USP)

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