Conjugação de fluoróforos a anticorpos - Faça Você Mesmo

Você alguma vez já teve que deixar de usar uma combinação de anticorpos em citometria porque eles eram da mesma cor? Pois seus problemas acabaram!

Uma técnica que nós usamos muito nos laboratórios onde eu trabalho é a conjugação de fluoróforos a anticorpos mono ou policlonais (fluorescent antibody labeling Tabajara) para gerar novos reagentes para citometria de fluxo e imunofluorescência. Embora essa seja uma técnica simples e extremamente útil, é surpreendente como ela é pouco difundida entre os imunologistas.

Basicamente, a técnica consiste na conjugação de fluoróforos (como FITC, CyX ou AlexaXXX) diretamente a anticorpos purificados (ou qualquer outra proteína) por meio de uma reação química que liga o fluoróforo a lisinas presentes na superfície da proteína. A reação é bem simples e pode ser feita em qualquer laboratório. As vantagens de dominar essa técnica são óbvias, e incluem:

1) a possibilidade de comprar um só tubo de anticorpo purificado e conjugá-lo a vários fluoróforos diferentes (como FITC ou Alexa488 (FL-1), Cy5 ou Alexa647 (FL-4), Alexa700 (que é lido pela maioria dos citômetros mais modernos) e Cy3 ou Alexa546 (mais propício para microscopia de fluorescência). Isso não só diminui muito o preço do reagente (especialmente no caso do FITC, que é muito barato) como também permite novas combinações de anticorpos que ás vezes não seriam possíveis só com reagentes comerciais;

2) a melhora da especificidade de algumas reações - reações usando anticorpos diretamente conjugados a fluoróforos sao em geral mais específicas do que reações usando anticorpos secundários;

3) a possibilidade de gerar reagentes para imunofluorescência e citometria a partir de anticorpos mono ou policlonais gerados no próprio laboratório.

Como o meu laboratório tem muitos anos de prática com essa técnica, coloquei o nosso protocolo (extremamente detalhado) à disposição aqui.

Aproveitem!

Abraço

Avanços na Pesquisa com os Eicosanóides: Novas Implicações Terapêuticas

A enzima 5-lipoxygenase, visivel como pontos marrons em lesão arterial.
Crédito: SPANBROEK ET AL., PNAS 100, 1238 (2003).

Por Elyara Maria Soares

Os eicosanóides são produtos do metabolismo do ácido araquidônico (AA) liberados após ativação celular por toxinas (Suttorp, N. 1985), complexos imunes (Rouzer, C.A. 1982), patógenos ou mediadores solúveis (Funk, C.D. 2001). Estes fatores produzem distúrbio da membrana celular e aumento de cálcio intracelular que resulta na translocação da fosfolipase A2 citosólica para as membranas nuclear e citoplasmática, culminando na liberação do AA dos fosfolipídios de membrana. O AA liberado pode ser metabolizado por diversas vias dando origem às prostaglandinas (PGs), tromboxanos, lipoxinas 15-HETE e aos leucotrienos (LTs), substâncias estas chamadas coletivamente de eicosanóides (Peters-Golden, M 1998 e 2007).
Recentemente diversos trabalhos demonstraram o importante papel dos eicosanóides em implicações para novos modelos terapêuticos, em especial os leucotrienos. Estas moléculas são sintetizadas durante uma infecção, atuam na célula via receptores acoplados à proteína G, gerando subseqüentes sinais intracelulares, que culminam no aumento do influxo celular, capacidade fagocítica e microbicida e ainda geração de outros mediadores (Peters Golden M, 2005 e 2007).


Do ano de 2007 até o presente, o grupo da Profa. Dra. Lúcia Helena Faccioli, FCFRP/USP, vem investigando novos avanços nessas implicações terapêuticas, entre outros trabalhos, uma nova estratégia para a modulação da resposta imune, por administração de leucotrieno B4 (LTB4) e prostaglandina E2 (PGE2) através de micropartículas (Nicolete, R 2007, 2008, Dos Santos, D 2009). Estes estudos continuam em desenvolvimento e associados a outros trabalhos descritos na literatura, contribuem para os novos avanços na terapêutica. No presente ano, diversas revisões e artigos enfatizaram os possíveis papéis de novos receptores para os cisteinil leucotrienos (R.K. Singh; Jesper Z. Haeggström 2010) e a intervenção dos mesmos em múltiplas doenças. Como exemplo pode ser citado o leucotrieno E4, recentemente descrito como um alvo bem atrativo e que pode ser utilizado como terapia em doenças como a asma e outras doenças alérgicas (Scadding GW, 2010).

O grupo do Prof. Dr. Marc Peters Golden, também tem participação ímpar na pesquisa dos mecanismos de ação destes eicosanóides (Aronoff DM, 2004; Lee SP, 2009; Medeiros, AI 2009).
É importante também lembrar que alguns trabalhos têm descrito o problema do uso de antagonistas de receptores dos leucotrienos no tratamento da asma, por exemplo. A falta de resposta à esses antagonistas pode desencadear algumas doenças, e para tanto a terapia com estes antagonistas de receptores não deveria ser utilizada. O trabalho foi publicado por Droszcz W., 2010, na revista Pneumonol Alergol Pol. Outros trabalhos também têm salientado a importância da terapia “anti-leucotrienos”, mas existem muitos aspectos ainda a serem elucidados.

No mês de maio deste ano, tivemos em Ribeirão Preto na FMRP-USP o curso de “Mediadores Lipídicos como Moduladores da Resposta Imune”, coordenado pela Profa. Dra. Lúcia Helena Faccioli que contou com ilustres nomes na área.
Contamos com palestras e seminários, sobre recentes dados e atualizações sobre os mediadores lipídicos dos grupos coordenados por: Dra Lúcia H. Faccioli (FCFRP-USP), Dra Alexandra Ivo de Medeiros (FCFAR-UNESP), Dr Auro Nomizo (FCFRP-USP), Dr David Aronoff, Dr Peter Mancuso e Dr Jason Weinberg (University of Michigan –USA) e ainda Dra Ruxana Sadikot (University of Illinois-USA) e Dr Stokes Peebles (Vanderbilt University-USA). Contamos também com Dra Elizabeth Meade (Cayman), onde foram discutidos métodos para quantificação dos eicosanóides.

Outros colaboradores como Dra Fabiani Frantz, Dr Carlos Sorgi, Dra Claudia S. Bitencourt e Dra. Glória E. Petto de Souza (FCFRP-USP), também Dra. Sônia Jancar (ICB-USP) participaram deste evento, onde contamos com trabalhos que exploram sobre a via da 5-lipoxigenase e seus produtos na defesa do hospedeiro, os eicosanóides e a expressão gênica, os produtos das ciclooxigenases e as infecções bacterianas, receptor ativador de plaquetas e a resposta imune inata, a supressão da resposta imune inata por produtos das cicloxigenases e ainda o papel destes mediadores na defesa contra patógenos como Histoplasma capsulatum, Mycobacterium tuberculosis e Strongyloides venezuelensis.

Deixo aqui então algumas sugestões de leitura para aqueles que quiserem saber um pouco mais sobre o papel destes mediadores lipídicos e a ação farmacológica de seus agonistas e antagonistas na patogênese, no tratamento e prevenção de doenças como a asma, aterosclerose e também um pouco da metodologia utilizada para o desenvolvimento das mesmas nos modelos experimentais.

Imunologista critica “Big Science”

"Sou cético". Assim termina a curta entrevista com Jan Klein, publicada no Web of Stories, onde o imunologista critica as pesquisas da chamada "Big Science", como genômica e proteômica. Para ele, além dos investimentos nestas pesquisas serem desperdício de dinheiro, “não é assim que se faz ciência”. O termo “Big Science” foi cunhado ao final da década de 1960 pelo físico Alvin M. Weinberg, ao avaliar como a organização e financiamento de grandes projetos impacta a natureza do questionamento científico.

Web of Stories • Jan Klein • The future of biology

Klein, conhecido por seus estudos em MHC, biologia evolutiva e imunogenética, se mostrou preocupado com os rumos que as ciências biológicas tomaram: vamos sequenciar, vamos comparar, sem necessariamente uma pergunta básica e clara fundamentando a pesquisa. “Espero que essa fase passe”, disse. “A biologia precisa ser fundamentalmente baseada em experimentos”, complementou.

A pesquisa em ciências biológicas e médicas vive um momento único, com uma miríade de dados (que o diga o gigante BGI), e pouca gente e infraestrutura para processar, analisar e guardar tanta informação.

E você? Concorda com Jan Klein?

A resposta do CNPq sobre a repostagem da Folha de S. Paulo

Nota do CNPq sobre Importações científicas

A matéria publicada pela Folha de S. Paulo no dia 03/07, com o título “Nova regra dificulta ainda mais importação científica” (mostrada aqui no Blog, no texto postado minutos antes desta postagem), gerou uma série de questionamentos por parte da comunidade científica quanto ao real papel do CNPq na importação de insumos e equipamentos científicos para a pesquisa.

Cabe esclarecer que o principal papel do CNPq é credenciar instituições e pesquisadores para fazer importações com o benefício da isenção de impostos. São cerca de 430 instituições e 4.334 pesquisadores credenciados. Nas importações operacionalizadas pelos credenciados, os licenciamentos de importação são registrados pelas próprias instituições ou pesquisadores e têm que ser analisados e confirmados pelo CNPq, que verifica compatibilidade de itens e quantidades. Por mês, são analisados cerca de sete mil licenciamentos de importação que totalizaram, em 2009, cerca de 590 milhões de dólares importados por instituições de pesquisa.

Assim, a maioria destas importações (98%) é feita diretamente pelas instituições e pesquisadores credenciados e o CNPq apenas verifica e autoriza as importações. Historicamente, o CNPq ainda ajuda instituições que tenham dificuldades de realizar importações próprias, realizando todo o processo de importação, incluindo o desembaraço em Brasília e subsequente transporte (aéreo e terrestre) até o destinatário. Estas operações totalizaram, em 2009, 11,8 milhões, ou seja, cerca de 2% do total de importações que o CNPq autorizou.

O CNPq, dessa forma, não começou a transferir às universidades e institutos de pesquisa a responsabilidade pelo processo de importação, como afirma a reportagem. Para a eficiência do sistema como um todo, a prioridade é dada para a função regulatória do CNPq - ou seja, credenciamento e autorização de importações pelas instituições científicas do país - e por isso, as atividades executivas como realizar importações para algumas instituições espalhadas pelo território nacional podem ficar afetadas.

Uma atividade que tem dado resultados positivos realizada pela equipe de importação do CNPq é dar mini-cursos (2 dias) de treinamento para equipes de importação das instituições credenciadas, o que as torna muito mais eficientes na importação direta, evitando a intermediação executiva do CNPq.

Assessoria de Comunicação do CNPq

Fonte: http://www.cnpq.br/saladeimprensa/noticias/2010/0707.htm

O CNPq e as importações

O texto abaixo saiu recentemente no Jornal da Ciência, inspirado em uma reportagem da Folha de São Paulo. Trata-se de um tema que interessa muito aos pesquisadores brasileiros: regras de importações.

Nova regra dificulta ainda mais importação científica

CNPq quer que universidades cuidem do processo, mas falta estrutura. Cientistas dizem que eles mesmos terão de cuidar da burocracia, que inclui até pagar despachante aduaneiro

O programa de importação do CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico), chamado Importa Fácil, está dificultando a vida de quem precisa de material de fora do país para fazer pesquisa, argumentam cientistas.

O programa existe desde 2004, mas agora o CNPq começou a transferir às universidades e institutos de pesquisa a responsabilidade pelo processo de importação.

O problema é que as universidades não têm estrutura para fazer isso. Resultado: a burocracia acaba nas costas do próprio cientista, que precisa cuidar até do pagamento do despachante aduaneiro - cuja conta pode representar até um terço do valor do material importado.

"Pode-se ter atrasos de seis meses na pesquisa. Nos EUA e Europa, o suprimento de novos insumos leva um ou dois dias", afirma Jorge Kalil, imunologista da USP.

Kalil teve recentemente um pedido de importação devolvido pelo CNPq. A instituição afirmou que não fará mais importações. "Quem as fará? Eu?" -questiona.

A diretora de administração e financiamento do CNPq, Nívia Wanzeller, explica que a ideia do CNPq é que o processo de compra de material importado seja feito pela universidade ou instituição do cientista.

"Se for preciso, o CNPq oferece treinamento técnico sobre o processo para universidades e instituições de pesquisa", afirma Wanzeller.

O CNPq é a principal instituição nacional que cuida dos trâmites de importação de material de pesquisa. Além dele, as fundações de amparo à pesquisa dos Estados também podem ajudar.

A Fapesp (Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo) tem uma equipe que cuida dos processos de importação previstos nos auxílios à pesquisa.

"Nos Estados sem essa estrutura, não imagino como se faz pesquisa", diz a geneticista Mayana Zatz, diretora do Centro de Estudos do Genoma Humano da USP.

As dificuldades aumentam no caso de animais vivos (como ratos para experimentos), material biológico (como DNA) e de material que precisa de refrigeração.

"Chegamos a devolver material genético que recebemos como doação no final do ano passado, tamanha foi a burocracia para entrada no país", lembra Zatz.

Conforme o valor do produto importado cresce, os obstáculos também se tornam maiores, e a espera pode chegar a seis meses.

Os reflexos dos entraves na importação são piores na área da saúde. De acordo com Zatz, para que as pesquisas não sejam interrompidas, muito material é importado com antecedência, o que atrapalha o armazenamento.

"São meses para conseguir trazer material para pesquisa. Quando chega, não sabemos se está em boas condições", reclama ela.

Zatz e Kalil estão liderando um grupo de cientistas que quer propor mudanças nas condições de importação. A ideia é tratar dos entraves, das regras da Anvisa (Agência Nacional de Vigilância Sanitária) e da criação de estrutura nas universidades para coordenar os pedidos.

"Cada instituição deveria ter algo como as atuais agências de inovação das universidades estaduais paulistas, para cuidar da captação e administração dos recursos para importação", analisa Zatz. "É o que existe em todas as universidades americanas."

(Sabine Righetti)
(Folha de SP, 3/7)

Fonte: http://www.jornaldaciencia.org.br/Detalhe.jsp?id=71932

Artigo na Nature Immunology sobre Imunologia na América do Sul

Wilson Savino, juntamente com colegas da Argentina e do Chile, publicaram recentemente um artigo sobre a situação da imunologia na América do Sul: Immunology south of the equator in the Americas. Gabriel A Rabinovich, Alexis M Kalergis, Norberto W Zwirner & Wilson Savino Nature Immunology 9, 1087 - 1090 (2008) doi:10.1038/ni1008-1087).

“Despite a troubled economic and political past, a tradition of fundamental research in immunology and infectious diseases has been fostered in Argentina, Brazil and Chile, as well as in other South American countries.”

“… a strong tradition of science thrives in the atmosphere of many South American institutions of higher education and research. Motivated by new public and private incentives in the past decade that have stimulated science and technology, as well as the possibility of creating stronger ties with international institutions and industry, young, talented immunologists are establishing independent careers in the region, thus avoiding the trend toward 'brain drain' to other countries and boosting the region's profile on the science and technology map. In this commentary we summarize the origin, present status and future challenges facing immunology research in Argentina, Brazil and Chile.”

Leia o artigo completo.

Anticorpos neutralizantes contra o HIV: Novos achados

Bethesda, 10 de Julho de 2010.

Dois anticorpos, VRC01 e VRC02, identificados no sangue de pacientes infectados pelo HIV, ligam-se no sítio de interação da molécula CD4 com o HIV e parecem prevenir a infecção de linfócitos T. Este resultado muito bem vindo à ciência foi publicado pelo grupo do Dr. Peter Kwong, daqui do Vaccine Research Center, NIAID/NIH no dia 8 de Julho na revista Science.

O Anthony Fauci, diretor do NIAID (National Institute of Allergy and Infectious Diseases), parte do National Institutes of Health comentou: "The discovery of these exceptionally broadly neutralizing antibodies to HIV and the structural analysis that explains how they work are exciting advances that will accelerate our efforts to find a preventive HIV vaccine for global use"

Os autores determinaram a estrutura atômica da molécula VRC01 quando esta se encontra ligada ao HIV. Desta maneira, foi possível definir como o anticorpo funciona, além de localizar o ponto exato de ligação ao vírus. Este conhecimento deverá facilitar o design de futuros candidatos a vacinas que podem estimular a produção de anticorpos similares ao VRC01, prevenindo a infecção pelo HIV.

O grande desafio para o desenvolvimento de uma vacina bem sucedida contra o HIV tem sido acreditado ao fato de que o HIV modifica freqüentemente as suas proteínas de superfície, o que resulta em um excelente mecanismo de evasão das respostas imunológicas. Neste contexto, vários estudos anteriores resultaram em achados desanimadores. A grande vantagem dos anticorpos VRC01 e VRC02 é que o local de ligação destas moléculas se mantém constante apesar das diversas mutações virais. Ou seja, estes anticorpos se ligam em porções bastante conservadas de moléculas virais.

O primeiro autor do trabalho fez as seguintes declarações: "What is different here is that we are attempting to replicate a natural human response" ... "Our findings show that the human immune system is capable of generating antibodies that are individually capable of neutralizing most strains of HIV-1. Moreover, these antibodies are not 'freaks of nature,' but ones that appear capable of being made by most humans".

As análises ainda revelam que os anticorpos VRC01 e VRC02 neutralizaram mais cepas de HIV e com maior afinidade do que os anticorpos descritos previamente. Os autores estimam que juntos, estes dois anticorpos poderiam impedir a infecção experimental de células humanas por mais de 90 cepas conhecidas do HIV.

Ainda não temos uma vacina, mas um grande avanço foi dado na busca de uma abordagem melhor sucedida na prevenção e tratamento das infecções pelo HIV.

Fonte: Tongqing Zhou, Ivelin Georgiev, Xueling Wu, Zhi-Yong Yang, Kaifan Dai, Andrés Finzi, Young Do Kwon, Johannes Scheid, Wei Shi, Ling Xu, Yongping Yang, Jiang Zhu, Michel C. Nussenzweig, Joseph Sodroski, Lawrence Shapiro, Gary J. Nabel, John R. Mascola, and Peter D. Kwong. Structural Basis for Broad and Potent Neutralization of HIV-1 by Antibody VRC01. Science, July 8th. DOI: 10.1126/science.1192819

Figure: This image shows the atomic structure of the antibody VRC01 (blue and green) binding to HIV (grey and red). The precise site of VRC01-HIV binding (red) is a subset of the area of viral attachment to the primary immune cells HIV infects. (Credit: NIAID VRC). http://www.sciencedaily.com/releases/2010/07/100708141531.htm

The Toll-like receptor 4 ligands Mrp8 and Mrp14 are crucial in the development of autoreactive CD8+ T cells

O descobrimento dos receptores do tipo toll (TLR) expressos em células da imunidade inata e o modo pelo qual a sinalização via esses receptores influencia a atividade das mesmas teve um impacto imenso na maneira de entendermos o curso de respostas imunes. Uma pequena mostra disso é a explicação que costumamos encontrar em livros textos de como uma infecção pode favorecer o desenvolvimento de doenças autoimunes. A ativação de células dendríticas via TLR4, por exemplo, deve levar a um aumento da expressão de moléculas de MHC e de moléculas co-estimuladoras e, na eventualidade desta célula apresentar um antígeno próprio para um linfócito auto-reativo, uma doença autoimune pode se desenvolver. Um artigo publicado na edição de junho da Nature Medicine descreve uma outra forma de relacionar a sinalização via TLR4 e o desenvolvimento de doenças autoimunes. Segundo Loser e colaboradores, a expressão de moléculas associadas à injúria tecidual tais como Mrp8 e Mrp14 está muito aumentada em várias doenças autoimunes. Essas moléculas são capazes de sinalizar via TLR4 para induzir o desenvolvimento de células T CD8+ auto-reativas produtoras de IL-17. O desenvolvimento das céulas T CD8+, no entanto, não se daria indiretamente via modificação da função da célula apresentadora de antígenos. As próprias células T CD8+ expressando TLR4 passam a produzir IL-17 e são capazes de levar ao desenvolvimento da doença autoimune quando ativadas na presença de Mrp8, Mrp14 (além da ligação CD40L-CD40). Abre-se portanto uma nova perspectiva na qual a resposta inflamatória, ao induzir a expressão de moléculas associadas à lesão tecidual, interfere diretamente com células da imunidade adaptativa via receptores usualmente relacionados com a imunidade inata no sentido de potencializar o desenvolvimento de doenças autoimunes. Boa leitura aos que se interessarem pelo assunto.

Efeito da deficiência de nutrientes na resposta Th1 vs Th2

Post de Johan van Weyenbergh

Foi publicado recentemente um artigo interessante sobre a influência de deficiências de micronutrientes na resposta Th1 vs Th2, na malária. O balanço Th1 vs Th2 tem sido valorizado na resposta a diversos patógenos e o estudo dos fatores capazes de influenciar a predominância de um dos braços se reveste, assim, de interesse.

O trabalho Effect of nutrient deficiencies on in vitro Th1 and Th2 cytokine response of peripheral blood mononuclear cells to Plasmodium falciparum infection (Malaria Journal 2010, 9:162; doi:10.1186/1475-2875-9-162) utilizou células mononucleares do sangue periférico de crianças (6 a 72 meses de idade) foram estimuladas por hemácias parasitadas por P. falciparum e as respostas de grupos de indivíduos com ou sem deficiências de micronutrientes foram comparadas. A deficiência de zinco se associou com um aumento da produção de TNF e IFN-g, enquanto a deficiência de magnésio se associou com o aumento da produção de IL-13 e redução de IFN-g. 

Há várias publicações sobre tais efeitos em diferentes enfermidades, mas tem havido pouco aprofundamento nos mecanismos que explicariam estas observações (Kocyigit et al., 2002; Amini et al., 2009; Malafaia et al, 2009,). Trabalho anterior do nosso grupo, em leishmaniose (Zinc/copper imbalance reflects immune dysfunction in human leishmaniasis: an ex vivo and in vitro study BMC Infectious Diseases 2004, 4:50; doi:10.1186/1471-2334-4-50) demonstrou um decréscimo dos níveis plasmáticos de zinco em pacientes com leishmaniose tegumentar e também nos pacientes com leishmaniose visceral, em relação aos controles. Também foi notada uma elevação dos níveis plasmáticos de cobre. As razões Cu/Zn foram mais altas em pacientes com resposta imunocelular deficiente (VL<ex vivo de IFN-g (após estímulo com antígeno de leishmania) e correlacionou negativamente com os níveis plasmáticos de cobre.

Gostaríamos de salientar que este sistema ex vivo consiste no estimulo das células do sangue total, incluindo a resposta inata (neutrófilos), e mais importante: o plasma autologo contendo, entre outros, os micronutrientes (no caso da VL e LCL: o Cu em excesso), anticorpos, complemento etc. No sistema in vitro usado por Mbugi et al. (e também na maioria dos trabalhos estudando a resposta imune in vitro nas doenças infecciosas) apenas os PBMC são estimulados, e sempre na deficiência de Zn, já que o meio de cultura não o contem e o plasma/soro (humano ou bovino) e acrescentado em apenas 2-10% (resultando em 1-2 ug/ml de Zn em vez de 10-20 ug/ml em plasma não-deficiente.

O trabalho de Mbugi et al. é baseado nos resultados do estímulo in vitro de PBMCs do impressionante numero de 304 crianças de área endêmica para P. falciparum. Porém, devemos interpretar estes dados com cautela, devido a  falhas e omissões neste trabalho:

1. Os dados das citocinas foram duplicados/desdobrados em dois manuscritos (um sobre produção em 24h, outro sobre produção aos 7 dias de cultura, incluindo marcação intracelular), ambos publicados na Malaria J com um mês de diferença. No entanto, no artigo de maio os autores declaram que as amostras foram coletadas num intervalo de tempo único e que não era possível determinar a fonte celular. “The design of our study does not allow time-dependent production of cytokines, or to establish specific cell subsets are sources of the cytokines measured.”;

2. No artigo de maio, a interpretação da significância estatística é altamente inovadora (um limite de p=0.15 é usado para determinar a significância). No artigo de junho, faltam os dados da Tabela 2 com os valores do p;

3. Não são mostrados os dados do estimulo com eritrócito não-infectado (controle negativo) e anti-CD3/CD28 (controle positivo), apesar do provável efeito das deficiências de micronutrientes sobre esta resposta, de acordo com diversos trabalhos publicados por outros grupos. Tampouco são mostrados ou comentados os dados da quantificação intracelular das citocinas, a possível correlação com sobrenadante ou a sua possível associação com deficiências;

4. Os valores são muito baixos para todas as citocinas, para algumas mesmo abaixo do limite de detecção do método usado (CBA): 2 pg/ml para IL-12, 3 pg/ml para TNF, 3 pg/ml para IL-10;

5. Os autores não comentam sobre a possível influencia do heme (p.ex. dados do nosso grupo: Andrade et al. J Immunol 2010) derivado dos eritrócitos infectados usados neste estudo;

6. A maioria dos trabalhos (Mbugi et al., o nosso e vários outros) dosam Zn plasmático e não sérico, por causa da hemólise (pode aumentar o Zn e Fe liberado das hemacias);

7. Finalmente, apesar das conclusões sugeridas nos dois manuscritos, os autores comprovaram o contrário da hipótese formulada. Ou seja, que as deficiências em micronutrientes NÃO são associadas a resposta imune (produção de citocinas in vitro). “In none of these cases, however, was such interaction supported by statistical evidence, as indicated by the high P-values in Figures 2 and 3. In other words, there is no evidence that the relationships between nutrient markers and cytokines depend on malarial infection.” Com o n impressionante deste estudo, parece bastante comprovada esta falta de associação, ou pelo menos dentro da metodologia proposta por Mbugi et al.

Como uma célula responde ao TNF-alfa e ativa NFkappaB? Processamento de informação analógico e ativação digital

Um estudo publicado na edição de hoje da revista Nature mostra como acontece o processamento de informação e ativação celular mediados pelo famoso NFkappaB. Os autores acoplaram uma técnica de high-throughput de cultura de células em microfluidos (microfluidic cell culture system; para saber mais sobre essa técnica acesse o link http://pubs.acs.org.ezproxy.med.nyu.edu/doi/full/10.1021/ac071311w) à microscopia de fluorescência, análise de expressão gênica e modelos matématicos para avaliar como células individuais respondem a diferentes níveis de estimulação pelo TNF-alfa.

Fibroblastos 3T3 fluorescentes de camundongos foram cultivados em câmaras de microfluido e expostos a 10 diferentes concentrações de TNF-alfa. Os resultados mostraram que as células, quando analisadas individualmente, enfrentam dois tipos de cenários após estimulação com TNF-alfa: 1) ativação digital (tudo ou nada), ou seja, a atividade nuclear total de NFkB foi semelhante independentemente da concentração de TNF-alfa utilizada; e 2) processamento de informação analógico (gradual): células expostas a baixos níveis de TNF-alfa demoraram mais para se ativarem do que células expostas a altos níveis dessa citocina. Os autores desenvolveram também um modelo matemático que foi capaz de reproduzir com fidelidade a dinâmica da ativação do NFkB revelada por métodos convencionais, como análise de expressão gênica e microscopia. Esse modelo poderá ser utilizado para prever os efeitos da sinalização pelo NFkB em diferentes tipos celulares.

A técnica de cultivo de células em câmara de microfluidos parece bastante promissora, e pode ser uma alternativa elegante aos tradicionais ensaios in vitro onde colocamos nossas células para interagir com plástico para tentar entender como sistemas biológicos complexos funcionam. Em termos de aplicação direta, essa técnica pode ser utilizada, por exempo, para o teste de susceptibilidade de células à diferentes drogas.

Para ler o artigo clique no link http://www.nature.com/nature/journal/v466/n7303/full/nature09145.html